CALIF. Biodistribution de nano-cargos lipidiques par imagerie de fluorescence: de la cellule à l'animal
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- Jean-Pascal Beaudry
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1 CALIF Biodistribution de nano-cargos lipidiques par imagerie de fluorescence: de la cellule à l'animal S. Hirsjärvi, C. Passirani, E. Garcion, F. Hindré, J-P. Benoît (Inserm U1066, LUNAM Université, Angers) J. Gravier, I. Texier (DTBS, CEA/LETI, Grenoble) Y. Qiao, A. Royère, J. Bibette (Laboratoire Colloïdes et Materiaux Divisés, ESPCI, Paris) S. Dufort, L. Sancey, A. Karageorgis, J-L. Coll (Inserm U823, IAB, Université J. Fourier, Grenoble) Journées Nationales Nanosciences et Nanotechnologies 2012
2 Nanomédecines et et tumeurs : : ciblage passif versus ciblage actif Imagerie ciblage optique actif vs Scintigraphie -Méthode rapide, sensible (pico molaire) et multi-échelle (de la cellule au corps entier) -Suivi dans le temps (pas de décroissance) -Sans rayonnement ionisant -Faible coût des équipements et infrastructures -Possibilité de sondes activables : Effet EPR (Enhanced Permeability and Retention Effect) «FF» «N»
3 bjectifs Influence de la taille et des caractéristiques de surface sur les propriétés physico-chimiques et biologiques de nanovecteurs lipidiques (nanoémulsions et nanocapsules) Développement de techniques d imagerie de fluorescence pour le suivi des biodistributions et d intégrité in vivo des vecteurs Ciblage actif de tumeurs à l aide de ces nanovecteurs décorés de peptides RGD
4 Formulation des nanovecteurs lipidiques (Procédés sans solvant) Nanocapsules lipidiques (LNC) Triglycérides, eau, NaCl, ATA pegylé, Lécithines Chauffage Agitation Cycles de T Agitation 85 C 65 C Trempe LNC Nanoémulsions lipidiques (LNE) Structure de lipoprotéines 3 tailles : 25, 50 et 100 nm Eau, NaCl, ATA pegylé LNC Nanocapsules lipidiques Huile, Suppocire, Lécithines Ultrasonication Cœur huileux liquide Mbne plus rigide : densité plus élevée de PEG 660, lécithines 60 C LNE LNE Nanoémulsions lipidiques Cœur huileux visqueux Mbne plus fluide : densité moins élevée de PEG 2000, lécithines
5 Formulation des nanovecteurs lipidiques H H H NH2 H H NH 2 n H H R 1 NH H Modification de surface : chitosane, dextrane... R 1 = LNC Ø 50 nm, ζ -3 mv Lipochitosane 37 C, 1h (C 18 ) LNC lipochitosane Ø 55 nm, ζ 30 mv Hirsjärvi et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. (2010) 76, 200
6 nm Marquage des nanovecteurs (in vitro & in vivo) Encapsulation de Sondes fluorescentes Complexe radioactif (γ) a. b. Fluorophore ou complexe radioactif N C 18 H 37 - C l n N C 18 H 37 DiI, DiD, DiR (n = 1, 2, 3 resp.) N N Ballot et al. Eur J Nucl Med Imaging (2006), 33, 602 C 18 H 37 - C l Di C 18 H 37
7 Ciblage passif : Biodistribution par imagerie optique dans un modèle murin de tumeur DiD-LNC et DiD-LNE nm Modèle HEK293(β3), IV Temps précoces Marquage de la périphérie avec les plus petites particules (effet plus net avec LNE) Biodistribution à 24h Profils semblables avec accumulation dans la tumeur Hirsjärvi et al. Nanomedicine sous presse
8 Imagerie optique vs. Scintigraphie Injection IV de LNC 50 nm contenant à la fois le 99m Tc et le DiD, modèle HEK293(β3) Comparaison des profils de biodistribution (24h) 99m Tc and DiD normalized by bone liver adrenal spleen kidney ovary lung intestine bone uterus bladder heart pancreas fat skin muscle stomach tumour brain 99mTc-LNC DiD-LNC La fluorescence sous-estime la quantité de LNC dans les organes fortement irrigués (foie, rate, rein, poumon, coeur). La décorrélation plus accentuée pour les LNE pourrait traduire leur métabolisation plus rapide. 8
9 Fluorescence Intensity FRET efficiency FRET pour les nanovecteurs lipidiques Principe du FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Wavelength (nm) DiI DiI 0.6 mm DiD DiI 1.2 mm DiD DiI 2 mm DiD DiI 3 mm DiD DiI 4 mm DiD Internal DiD concentration (mm) Theoretical efficiency Experimental data Co-encapsulés dans les LNE, l émission du DiI diminue tandis que la fluorescence du DiD augmente (à gauche, λ d excitation 520 nm). Les sondes en solution suivent la même loi (à droite). Gravier et al. SPIE BIS Proceedings (2010)
10 Application du FRET in vivo Etude de l intégrité des nanovecteurs/tumeur Injection IV de LNC de 50 nm contenant le DiI et DiD Coupes de tumeur HEK Aucune LNC à 10 min LNC intactes dans les néo-vaisseaux à 60 min LNC intactes dans la tumeur à 180 min Vaisseau
11 Application du FRET in vivo Etude préliminaire de biodistribution Injection IV de LNC de 50 nm contenant le DiD et le FP730-C18 (proche infra-rouge) HEK293β3 1h 3h 5h 24h plasma Cell elements Total blood plasma Cell elements Total blood plasma Cell elements Total blood DiD FRET FP730-C18 plasma Cell elemen
12 Ciblage actif : Greffage de peptides sur des nanovecteurs lipidiques Dispersion de LNE LNE-H Phospholipides Greffage du ligand LNE-cRGD N D f G K R H N S maleimide PEG surfactant Cœur huileux LNE-cRAD Goutayer et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. (2010), 75, 137
13 Nanovecteurs lipidiques portant crgd/crad Etudes in vitro Reconnaissance (4 C) et internalisation (37 C) de LNE par les cellules HEK293(β3) La reconnaissance des récepteurs α v β 3 par le peptide crgd induit l internalisation Pas d effet avec le contrôle négatif crad Résultats semblables avec les LNC 15 min, 4 C 1h, 37 C Goutayer et al. Eur. J. Pharm. Biopharm. (2010), 75, 137
14 Ciblage actif : LNC portant crgd/crad - Etudes in vivo %ID/g %ID/g LNC-cRGD LNC 50 nm, IV, modèle U87MG Le profil de biodistribution n est pas influencé par le greffage Meilleure accumulation tumorale des LNCcRGD/temps précoces (1-3h) heart lung heart lung skin liver spleen pancreas adrenal kidney stomach skin liver spleen pancreas adrenal kidney stomach intestine LNC-cRAD intestine fat uterusovary fat uterusovary bladder muscle tumour brain blood carcass bladder muscle tumour brain blood carcass 1 h 3 h 24 h 1 h 3 h 24 h
15 Conclusions CALIF Nouveaux outils, nouvelles caractérisations obtenues Lipochitosane, résistance mécanique de la membrane des nanovecteurs (tensiométrie à goutte ) Avancées dans l apport de l imagerie optique par fluorescence util de screening mais difficilement quantifiable Etude de l intégrité des vecteurs par FRET in vitro et in vivo Ciblage actif de certaines tumeurs (vascularisées) démontré en utilisant les peptides RGD
16 Production scientifique 9 publications Hirsjärvi et al. Influence of size, surface coating and fine chemical composition on the in vitro reactivity and in vivo biodistribution of lipid nanocapsules versus lipid nanoemulsions in cancer models. Nanomedicine: NBM in press. Hirsjärvi et al. Evaluation of surface deformability of lipid nanocapsules by drop tensiometer technique, and its experimental assessment by dialysis and tangential flow filtration. Int. J. Pharm. (2012) 434, 460. Dufort et al. Physico-chemical parameters that govern nanoparticles fate also dictate rules for their molecular evolution. Adv. Drug Deliv. Rev. (2012) 64, 179. Gravier et al. Lipidots: competitive organic alternative to quantum dots for in vivo fluorescence imaging. J. Biomed. ptics (2011) 16, Dufort et al. Targeted delivery of a proapoptotic peptide to tumors in vivo. J. Drug Targeting (2011) 19, 582 Hirsjärvi et al. Passive and active tumour targeting with nanocarriers. Curr. Drug Discov. Technol. (2011) 8, 188. Dufort et al. ptical small animal imaging in the drug discovery process. Biochim. Biophys. Acta (2010) 1798, Hirsjärvi et al. Layer-by-layer surface modification of lipid nanocapsules. Eur. J. Pharm. Biopharm. (2010) 76, 200. Goutayer et al. Tumor targeting of functionalized lipid nanoparticles: Assessment by in vivo fluorescence imaging. Eur. J. Pharm. Biopharm. (2010) 75, manuscrits soumis / en préparation 7 articles/résumés de conférences
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18 Création d une start up en 2010 Lauréat du Concours National SE livier MEYER CARLINA Technologies SAS Amsler Biotech II 22 rue Roger Amsler Angers Tél: omeyer@carlinatech.com
19 WP1. Synthesis and physico-chemical characterization of the nano-cargos A g il T=2p/w A=f(t) g =f(t) T E e : equilibrium elasticity Water E ne : non equilibrium elasticity Time
20 WP1. Synthesis and physico-chemical characterization of the nano-cargos 25 nm 50 nm 100 nm Membrane deformability increases Hirsjärvi et al. to be submitted 20
21 % total CPM / g % total CPM / g % total CPM / g Biodistribution par γ- scintigraphie dans un modèle murin de tumeur Biodistribution de 99m Tc LNC nm heart lung skin liver spleen pancreas adrenal kidney stomach intestine 1.5 h 4 h fat uterusovary bladder muscle tumour brain blood carcass 45 Modèle HEK293(β3), IV les LNC de 50 & 100 nm se retrouvent dans la circulation aux temps précoces; les LNC de 25 nm diffusent en périphérie heart lung skin liver spleen pancreas adrenal kidney stomach intestine 24 h fat uterusovary bladder muscle tumour brain blood carcass Profils semblables à 24h heart lung skin liver spleen pancreas adrenal kidney stomach intestine fat uterusovary LNC 25 nm LNC 50 nm LNC 100 nm bladder muscle tumour brain blood carcass Hirsjärvi et al., submitted
22 Distribution In vivo comparaison des LNC et LNE Accumulation des LNE dans les PIMs (Macrophages Pulmonaires Intravasculaires) induits par la tumeur LNC Nanocapsules lipidiques LNE Nanoémulsions lipidiques Coll. A Le Pape CIPA, rléans Cœur huileux liquide Cœur huileux visqueux Mbne plus rigide : densité plus élevé de PEG 660, lécithines Mbne plus fluide : densité moins élevée de PEG 800, lécithines
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