Instrumentation utile en analyse omique par spectrométrie de Masse

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1 Instrumentation utile en analyse omique par spectrométrie de Masse Olivier Laprévote Lab. de Toxicologie Faculté de Pharmacie Paris Descartes 1. /9

2 SOMMAIRE Principes généraux Méthodes d ionisation Électronébulisation (Electrospray Ionisation: ESI) Ionisation Laser assistée par matrice (MALDI) Analyseurs de masse Temps de vol (Time-of-Flight: TOF) Quadripôles et trappes à ion Spectrométrie de Masse tandem (MS/MS) Principe Instrumentation Trappes à ion Q-TOF Orbitrap 2

3 Principes généraux Faible pression Introduction de l échantillon Source d ions M M (+/-) Analyseur M(+/-) m/z Détecteur m/z I Système de traitement des données 3 étapes essentielles: Ionisation de l échantillon Analyse des ions formés Détection du signal 3

4 Principes généraux Le spectre de Masse est un graphe en deux dimensions qui indique les valeurs d intensité (relatives ou absolues) en fonction des valeurs de m/z I A Intensité I B I C m C /z m B /z m A /z 4

5 Principes généraux Les ions, les isotopes, masses et distributions isotopiques Masses atomiques des constituants principaux des biomolécules isotope Masse atomique* Abondance (%) carbone 12 C 12 (définition) C hydrogène 1 H H azote 14 N N oxygène 16 O O O soufre 32 S S S S phosphore 31 P *par définition l unité de masse atomique vaut 1/12 de la masse d un atome de carbone 12 C et vaut: x1-27 kg 5

6 1 er exemple: C 6 Distribution isotopique théorique Masse mono isotopique Masse moyenne Selket: 6

7 1 er exemple: C 6 R = M/ M = 3 Selket: 7

8 1 er exemple: C 6 M/ M = 14 Selket: 8

9 1 er exemple: C 6 M/ M = 7 Selket: 9

10 SOMMAIRE Principes généraux Méthodes d ionisation Électronébulisation (Electrospray Ionisation: ESI) Ionisation Laser assistée par matrice (MALDI) Analyseurs de masse Temps de vol (Time-of-Flight: TOF) Quadripôles et trappes à ion Spectrométrie de Masse tandem (MS/MS) Principe Instrumentation Trappes à ion Q-TOF Orbitrap 1

11 Méthodes d ionisation Electronébulisation (Electrospray) John B. Fenn Prix Nobel de Chimie 22 Premiers spectres ESI présentés par Fenn et col. en 1988 au congrès de l ASMS. 11

12 Electronébulisation: Principe 12

13 Electronébulisation: formation du nébulisat (spray) 13

14 Processus Electrospray Gaz nébuliseur Lentilles de focalisation Contre-électrode Cône de Taylor Capillaire porté à un haut potentiel Gaz rideau (N 2, 8 C) 14

15 Exemple de spectre de protéine m/z 15

16 Effet de collision à l interface: désolvatation et activation par collision 16

17 H C N+ D transh + N H H H 2 N H H N H H N H N H+ cish + N H H 2 N N+ H Effet de stéréochimie: Spectre ESI à basse énergie de collision 17

18 Effet de stéréochimie: Spectre ESI à énergie de collision élevée 18

19 Miniaturisation de la source electrospray: le nanospray 19

20 2

21 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation) 21

22 MALDI cible réfrigérée (384 puits) 22

23 MALDI: Structures des principales Matrices CN CO 2 H Cl CO 2 H HO CH C COOH NH 2 OH HO CO 2 H CH CH CO 2 H OH OH N 4 CH 3 O OCH CO 2 H CO 2 H OH NO 2 N N OH 7 8 NO 2 CO 2 H OH N CO 2 H H C C CO 2 H H 9 1 N H 11 OH O OH O(CH 2 ) 7 CH 3 OH NO 2 12 HO COCH 3 OH 23

24 MALDI: principales Matrices 2,5 dihydroxy benzoïc acid (DHB) matrice adaptée pour les peptides, les sucres, les glycolipides, et les polymères synthétiques; C 7 H 6 O 4, m/z HO COOH OH α cyano-4-hydroxy cinnamic acid (HCCA) Bonne matrice pour les peptides et les protéines; C 1 H 7 NO 3, m/z CH C(CN)COOH HO 24

25 SOMMAIRE Principes généraux Méthodes d ionisation Électronébulisation (Electrospray Ionisation: ESI) Ionisation Laser assistée par matrice (MALDI) Analyseurs de masse Temps de vol (Time-of-Flight: TOF) Quadripôles et trappes à ion Spectrométrie de Masse tandem (MS/MS) Principe Instrumentation Trappes à ion Q-TOF Orbitrap 25

26 Principe de l analyse MALDI-TOF mv 2 = 2 zev v 2zeV m = t = xl m 2zeV MALDI-MS Laser UV m/z Analyseur TOF Détecteur V Matrice/Échantillon 26

27 Principe de fonctionnement du réflectron MALDI-MS Détecteur m/z Laser UV Analyseur TOF Mirroir Electrostatique V V Matrice/Échantillon 1 >V 27

28 Principe de fonctionnement du réflectron MALDI-MS Détecteur m/z Laser UV Analyseur TOF Mirroir Electrostatique V V Matrice/Échantillon 1 >V 28

29 Couplage ESI-TOF: L injection orthogonale Principe source modulateur Les analyseurs TOF sont adaptés idéalement à des sources d ions pulsées comme le MALDI. L injection orthogonale permet de coupler ces appareils à des sources d ions continues comme l électrospray (couplage LC/MS) ou à impact électronique (couplage GC/MS) La résolution (> 7) permet la mesure de masse exacte de petites molécules réflecteur détecteur x y z 29

30 Spectromètre de masse quadripolaire 3

31 Quadripôle: principe de fonctionnement Φ = - U + V cosω RF t Φ = U - V cosω RF t 31

32 Quadripôle: diagramme de stabilité 32

33 Quadripôle tridimensionnel: le piège à ions (Ion Trap) 33

34 Piège ionique quadripolaire entrance endcap electrode ring electrode exit endcap electrode r z 34

35 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité 35

36 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité Ions éjectés a z 8eU = 2 = mr ω 2 a z Ions piégés q z = mr 4eV 2 ω Suivant ces lignes iso-beta z, les ions adoptent tous un mouvement périodique d une fréquence donnée (fréquence séculaire) q z 36

37 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de stabilité En augmentant progressivement l amplitude de la tension alternative V appliquée à l electrode annulaire, on éjecte du piège progressivement les ions suivant l ordre croissant de leur masse. Générateur RF V t 37

38 Piège Ionique Quadripolaire: Diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = mr 4eV 2 ω 2 a z Ions piégés V= 5 volts q z 38

39 Piège Ionique Quadripolaire: Diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = mr 4eV 2 ω 2 a z Ions piégés V= 1 6 volts q z 39

40 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = mr 4eV 2 ω 2 a z Ions piégés V= 15 6 volts q z 4

41 Piège Ionique Quadripolaire: diagramme de Stabilité Ions éjectés q z = mr 4eV 2 ω 2 a z Ions piégés V= 2 6 volts q z 41

42 Analyseurs quadripolaires La résolution dépend de: La pente de la droite de fonctionnement (quad) De la vitesse de balayage De la gamme de masse analysée Un compromis est à trouver entre sensibilité et résolution En général on travaillera à résolution unitaire (séparation de m/z et de (m+1)/z) 42

43 SOMMAIRE Principes généraux Méthodes d ionisation Électronébulisation (Electrospray Ionisation: ESI) Ionisation Laser assistée par matrice (MALDI) Analyseurs de masse Temps de vol (Time-of-Flight: TOF) Quadripôles et trappes à ion Spectrométrie de Masse tandem (MS/MS) Principe Instrumentation Trappes à ion Q-TOF Orbitrap 43

44 MS/MS L art de faire fragmenter des ions stables 44

45 Notion de stabilité ionique L ionisation conduit à trois types principaux d ions Des ions stables: Ne se décomposent pas Constituent le pic indicatif du composé intact (molécule protonée ou cationisée, molécule déprotonée) Longue durée de vie Des ions instables: Disposent d une grande quantité d énergie interne Se dissocient dans la source d ions Leurs fragments sont observés sur les spectres de masse Des ions métastables: Disposent d une énergie interne «moyenne» Disposent d une durée de vie «moyenne» Se dissocient durant le vol entre la source et le détecteur 45

46 Information structurale Poids Moléculaire Éléments de structure = ion précurseur stable = ion précurseur instable Qualité de L information Poids moléculaire IE IC CH 4 IC NH 3 FAB ESI MALDI Polarité des composés Information structurale 46

47 Comment dissocier des ions stables? Par dissociation induite par collision L énergie est apportée, hors de la source, à l ion incident par collision inélastique contre un gaz rare (Ar, He) + E lab collision + Ion excité Lors de la collision, une partie de l énergie cinétique de l ion précurseur est convertie en énergie vibrationnelle: E CM = E lab [M C /(M C +M i )] + Fragments (neutres et ioniques) avec: E CM (énergie au centre de masse) E lab (énergie cinétique de l ion incident) M C (masse de la cible) M i (masse de l ion) 47

48 Notion d énergie de collision Relation entre énergie interne et énergie au centre de masse Energie de Collision (E lab ) Energie au centre de masse (E CM ) Energie interne (E int ) E int E CM Basse énergie de collision Haute énergie de collision 48

49 Notion d énergie de collision Processus majeurs obtenus par collisions multiples de basse énergie Energie interne P + ** P + * F 1 + * F 3 + P + F 1 + F 2 + Nombre de collisions S + L accumulation d énergie interne par des collisions successives de basse énergie est caractéristique des systèmes quadripolaires 49

50 Notion d énergie de collision Appareils quadripolaires: Basse énergie de collision Collisions multiples Efficacité de collision élevée Bonne transmission des fragments Spectres MS/MS pas toujours reproductibles (sauf précautions) Rendement et nature des fragmentations peuvent être optimisés Dépendance possible au mode de préparation des ions précurseurs Appareils TOF-TOF et magnétiques: Haute énergie de collision Peu de collisions (1 à 4) Faible section efficace de collision Spectres MS/MS reproductibles Peu de possibilités d amélioration du rendement de fragmentation Spectres MS/MS généralement peu dépendants du mode d ionisation 5

51 Spectromètre tandem Spectromètre conventionnel Source d ions Analyseur Détecteur Spectromètre «tandem» Source d ions Analyseur 1 (MS 1) Cellule de collision Analyseur 2 (MS 2) Détecteur Espace Temps 51

52 Collision de basse énergie Collision à l interface d une source electrospray Spectromètres tandem de basse énergie: Triples quadripôles Tandem quadripôle-tof Piège à ions (ion-trap) Orbitrap 52

53 Principales expériences MS/MS sur un triple quadripôle [ion précurseur] +/- [ions fragments] +/- + neutres Source d ions Q1 Cellule de collision q2 Q3 Détecteur m/z fixe Spectre d ions produits (ou d ions fils) m/z fixe Spectre d ions précurseurs (ou d ions parents) Spectre de perte de neutre m/z fixe m/z fixe Sélection d une réaction (SRM, MRM) 53

54 Exemple d utilisation d un triple quadripôle RT: Relative Abundance TAG Sterols PE PI PC LPC APPI Time (min) NL: 7.97E8 TIC MS 91126_8 _ RT: Relative Abundance FFA PE Time (min) PI PS LPE PC LPC APPI - Séparation des lipides par classe Utilisation de la photoionisation à pression atmosphérique (APPI) NL: 2.71E8 TIC MS 91126_11 _

55 Détection spécifique de certains lipides R 1 O O R 2 O HO O P O O X O Famille Tête polaire X Mode d ionisation Mode de balayage PC ESI + PE ESI + PS ESI + HO O OH PI ESI - PG ESI - OH PA H ESI - N + NH 2 - O OH NH 3 + OH OH OH Précurseurs de 184 Perte de neutre 141 Perte de neutre 185 Précurseurs de 241 Précurseurs de 153 Précurseurs de 153 7

56 RT: Détection spécifique de certains lipides Relative Abundance PC Précurseurs de Time (min) NL: 3.46E7 TIC MS 9623_19 RT: Relative Abundance PE Perte de neutre Time (min) NL: 6.82E6 TIC MS 971_6 RT: SM: 7G Relative Abundance PS Perte de neutre Time (min) NL: 8.25E5 TIC MS 91118_6 RT: SM: 7G Relative Abundance PI Précurseurs de Time (min) NL: 3.3E5 TIC MS 1312 Séparation des lipides par longueur de chaîne Utilisation de l ElectroSpray (ESI) 8

57 Détection spécifique de certains lipides RT: SM: 7G Relative Abundance Perte de neutre Time (min) Céramides NL: 2.76E5 TIC MS 976_4 RT: Relative Abundance Précurseurs de Time (min) Sphingomyélines NL: 4.87E6 TIC MS 971_11 O O R OH NH OH R OH NH O O P O - O N + Séparation des lipides par longueur de chaîne Utilisation de l ElectroSpray (ESI) 9

58 OH Détection spécifique de certains lipides: sulfatides RT: Relative Abundance RT: 1.19 RT: 1.46 [M-H] - 97 RT: [M-H] - 54 RT: RT: 1.75 RT: 2.6 RT: RT: 2.42 C16 ST C18 ST C2 ST C22 ST C24:1 ST C24 ST Time (min) Relative Abundance RT: 1.7 RT: 1.98 RT: 1.97 RT: 2.35 RT: 2.74 C18-OH ST C2-OH ST C22-OH ST C24:1-OH ST C24-OH ST C26-OH ST Time (min) O R NH O OH O S O OH O O OH O - 1

59 Elucidation structurale de l ion à m/z : spectre d ions fils PE 38:4 7 combinaisons de chaînes 1 x R 1 O O HO O P O O NH R 2 O Relative Abundance O [M+H-R 2 CH=C=O] + 2:4 [M+H-R 1 CH=C=O] : m/z 14

60 Triples quadripôles: avantages et inconvénients Avantages: Pas de hautes tensions dans la source Haute vitesse de balayage Bonne transmission Bonne efficacité de la collision (confinement dans q2 en mode «RF-only») Inversion des modes positifs et négatifs possible sans ré-étalonnage Diverses expériences possibles simultanément (en fait en alternance rapide) L énergie de collision est modifiable sans affecter les valeurs de m/z : optimisation des ions diagnostics Sélection des fragments possible ainsi que celle des précurseurs: mode MRM très efficace et spécifique: appareil idéal pour les mesures quantitatives. Inconvénients Résolution seulement unitaire Spectres parfois peu reproductibles Basse énergie de collision 6

61 Spectromètre tandem quadripôle-tof Ions fragments Ion parent 61

62 Effet de l énergie de collision sur les spectres CID enregistrés avec un Q-TOF Leucine enképhaline [M+H] + m/z= 556,27 HO YGGFL b3 a4 b4 Sensibilité des voies de fragmentation de la leucine enképhaline à la quantité d énergie interne de l ion précurseur [M+H] +. O O Fragments : a 4 m/z 397.2, b 4 m/z 425.2, H 2N H N N H H N N H COOH b 3 m/z 278.1, y 2 m/z O O Energies d activation : y2 a 4 > b 4, b 3 > y 2 Niveau d excitation de l ion précurseur Les rapports d intensité ( b 3 /y 2 ) et (a 4 /b 4 ) reflètent la quantité d énergie interne de l ion précurseur. Le rapport ( b 3 /y 2 ) permet de limiter les effets optiques et de détection liés à la masse ( ions séparés seulement de 1 uma) 62

63 Effet de l énergie de collision sur les spectres CID enregistrés avec un Q-TOF Leucine enképhaline [M+H] + m/z= 556,27 Pour E Lab < 6 ev, distribution de fragments sur l ensemble de la gamme de masse. Pour E Lab > 6 ev, On observe uniquement des fragments de basse masse 63

64 Effet de l énergie de collision sur les spectres CID enregistrés avec un Q-TOF Abondance relative : I F+ / I Fi+ Ions produits a 4, b 4 : Evolution des abondances relatives des ions a 4, b 4 et du rapport d intensité a 4 /b 4, en fonction de l énergie de collision (Technique d ionisation : Thermospray) Pour E Lab < 2 ev: La formation de l ion b 4 est favorisée. Pour E Lab > 2 ev: La formation de l ion a 4 est favorisée. 64

65 EC= V Maltose (M+Na) + APPI a=3, e-4, t=8, e+1 1,15e4 365,294 1,1e4 1,5e4 1,e4 95, 9, 85, 8, 75, 7, 65, 6, 55, 5, 45, 4, 35, 3, 25, 2, 5,, 5, m/z,amu 65,

66 EC= 1V Maltose (M+Na) + APPI a=3, e-4, t=8, e+1 3,7e4 3,6e4 365,269 3,4e4 3,2e4 3,e4 2,8e4 2,6e4 2,4e4 2,2e4 2,e4 1,8e4 1,6e4 1,4e4 1,2e4 1,e4 8, 6, 4, 2,, m/z,amu, 66

67 2,6e4 2,7e4 EC= 2V Maltose (M+Na) + APPI a=3, e-4, t=8, e+1 365,278 2,5e4 2,4e4 2,3e4 2,2e4 2,1e4 2,e4 1,9e4 1,8e4 1,7e4 1,6e4 1,5e4 1,4e4 1,3e4 1,2e4 1,1e4 1,e4 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 35, , ,1936 m/z,amu 67,

68 EC= 3V Maltose (M+Na) + APPI a=3, e-4, t=8, e+1 365, , , , ,814 5,, m/z,amu ,129 6

69 8 822 EC= 4V Maltose (M+Na) + APPI a=3, e-4, t=8, e+1 365, , , , , ,11 245,1417 m/z,amu , ,184

70 EC= 5V Maltose (M+Na) + APPI a=3, e-4, t=8, e , , , , , , m/z,amu 7

71 Spectromètres Q-TOF: avantages et inconvénients Avantages: Ce sont les avantages liés à l utilisation d un quadripôle comme MS1 (voir plus haut) Ce sont les avantages liés à l utilisation d un TOF comme MS2: Haute sensibilité Haute résolution possible en mode MS (Q1 est «transparent») ou en MS/MS Inconvénients Par rapport au triple quadripôle, les spectromètres Q-TOF ne permettent pas la sélection d ions fragments (donc l enregistrement de spectres d ions précurseurs ou de perte de neutre) mais... des schémas analytiques astucieux permettent dans certains cas de pallier cet inconvénient... 71

72 Pièges à ions: MS n 72

73 Exemple d application de la MS n à l étude de métabolites d un polluant: Le Bisphenol A (thanks to Laurent Debrauwer) HO OH 73

74 Profils métaboliques du Bisphénol A chez la souris gestante 6 GlcA-BPA-OH GlcA-BPA Urine 3 H-dpm 4 2 GlcA-BPA-Glc 22c 22d F GlcA DH-BPA HO 3 S-BPA + HO-BPA BPA Tube digestif 3 H-dpm GlcA-BPA-OH GlcA-BPA 22a 22b F GlcA DH-BPA BPA GlcA-BPA BPA Foetus 3 H dpm 4 2 F time (min) 74

75 Relative abundance Relative abundance Relative abundance MS m/z MS m/z MS 3 (66-385) 157 Métabolite F : Spectres en ESI négatif m/z HO m/z 227 CH 3 C CH 3 m/z 385 O COOH O CH OH 2 OH O O OH OH OH H C NH 3 C O 75

76 Métabolite F : Spectres en ESI positif Relative abundance Relative abundance BPA MH m/z 24 MS MS GlcA BPA MNa m/z Relative abundance Relative abundance m/z 6 MS 3 (68-24) MS 4 ( ) CH 2 CO 168 -H 2 O -H 2 O m/z

77 Métabolite F : Spectres en ESI positif Relative abundance Relative abundance HO CH 3 C CH BPA O O m/z 24 MS MS GlcA BPA COOH OH O OH H 3 C C MH + O MNa m/z O m/z 38 CH 2 OH OH OH NH Relative abundance Relative abundance m/z 24 - H 2 O m/z CH 2 =O m/z m/z m/z 6 MS 3 (68-24) MS 4 ( ) CH 2 CO 168 -H 2 O -H 2 O m/z

78 Basse énergie de collision dans une trappe linéaire: LTQ-Orbitrap 78

79 Basse énergie de collision dans une trappe linéaire: LTQ-Orbitrap Energie de collision Influence de l énergie de collision: Amplitude de l impulsion d excitation, Collision avec des molécules d hélium (temps d activation constant) Leucine enképhaline [M+H] + m/z= 556,27 b 4 a 4 EC= 2 % a 4 EC= 6 % b 4 b 3 y 2 a 5 [M-H 2 O+H] + b [M-H 3 2 O+H] + y 2 a b 5 2 CID Leucine enképhaline, m/z= 556 Energies de collision 2 et 6 % pour un temps d activation de 3 ms. Comme attendu les rapports a4/b4 s inversent et l abondance de b3 augmente au regard de celle de y2: résultat analogue à ceux que l on obtient sur des TQ ou des Q-TOF 21 79

80 Basse énergie de collision dans une trappe linéaire: LTQ-Orbitrap Influence de l énergie de collision Leucine enképhaline [M+H] + m/z= 556,27 Evolution des rapports d intensité (a4/b4), (b3/y2) en fonction de l énergie de collision pour des temps d activation de 3 et 9 ms. Les rapports d intensité sont différents pour des temps d activation de 3 et 9 ms. 8

81 Basse énergie de collision dans une trappe linéaire: LTQ-Orbitrap Influence du temps d activation (énergie de collision constante) Leucine enképhaline [M+H] + m/z= 556,27 T: 3 ms T: 5 ms CID Leucine enképhaline, m/z= 556, Energie de collision 2 %,Temps d activation de 3 et 5 ms. L ion précurseur, majoritaire pour un temps d activation de 3 ms est entièrement dissocié à 5 ms. Les rapports d intensité des ions a 4 /b 4 et b 3 /y 2 sont inversés pour les deux temps d activation

82 Basse énergie de collision dans une trappe linéaire: LTQ-Orbitrap Influence du temps d activation (énergie de collision constante: 2 %) L allongement de la durée d activation favorise les processus de plus faible énergie! L allongement de la durée d activation favorise les processus dont la constante de vitesse est la plus faible 82

83 Pièges à ions: avantages et inconvénients Avantages: Appareils très sensibles Résolution unitaire en sélection d ions Possibilité de MS n Possibilité de réactions induites par collision Inconvénients Seul le mode descendant est permis (spectre d ions produits) Présence fréquente de pics artéfactuels Nombre d ions limité (problème de charge d espace, moins grave avec les trappes linéaires) Basse énergie de collision Gamme de masse limitée en MS/MS (perte de la partie inférieure du spectre) sauf modalités de balayage adaptées 83

84 LTQ Orbitrap TM Thermo Electron Corporation, Bremen, Germany 84

85 LTQ Orbitrap Finnigan LTQ Linear Ion Trap API Ion source Linear Ion Trap C-Trap Differential pumping Orbitrap Differential pumping Inventor: Dr. Alexander Makarov, Thermo Electron (Bremen) 85

86 LTQ Orbitrap: principe de fonctionnement 1. Les ions sont stockés dans la trappe linéaire 2.. Ils sont éjectés dans l axe 3.. Et piégés dans la C-Trap 4.. Ils sont regroupés en en petits paquets et injectés dans l Orbitrap 5.. Où ils sont piégés par un champ électrostatique, et tournent autour de l électrode centrale en subissant des oscillations axiales L oscillation des ions produit un courant image induit entre les deux moitiés de l orbitrap Le courant image (alternatif) est amplifié Les ions de masse donnée fournissent une seule longueur d onde/fréquence 86

87 Fréquences et masses La fréquence d oscillation axiale correspond à: où ω = fréquence d oscillation k = constante instrumentale m/z = ω = k m / z La somme des différents ions présents dans l orbitrap génère un signal complexe (superposé) dont les fréquences sont mesurées par transformée de Fourier 87

88 Performances Résolution > 6, à m/z 4 at 1 sec cycle Résolution maximale > 1, (FWHM) Exactitude < 5 ppm calibration externe Exactitude < 2 ppm calibration interne Domaine de masse 5 2,; 2 4, Débit 3 spectres haute résolution/seconde ou 4 spectres/seconde en parallèle (1 HR Orbitrap + 3 LR LTQ MS/MS scans) 88

89 Mesure de masse exacte M3 metabolite of Loperamide Orbitrap Loperamide_T15_MS3 # 34 RT: 4.91 AV: 1 NL: 8.98E7 F: FTMS + p ESI Full ms [ ] Relative Abundance C 28 O 2 N 2 ClH 31,.23 s/scan, 75 RP 1.7 ppm e5 charges m/z loperamide_t15_ms3_it_2e3_ms2 # 145 RT: 5.5 AV: 1 NL: 9.2E5 F: ITMS + p ESI Full ms [ ] LTQ Relative Abundance m/z 89

90 Mesure de masse exacte calculated R= 82, measured +.7 ppm 9