Mercodia Adiponectin ELISA

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1 Mercodia Adiponectin ELISA Mode d emploi REAGENTS FOR 96 DETERMINATIONS Pour utilisation diagnostique in vitro Usage homologué aux États-Unis : Destiné uniquement à la recherche A ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic. Fabriqué par Mercodia AB, Sylveniusgatan 8A, SE Uppsala, Suède

2 EXPLICATION DES SYMBOLES UTILISÉS SUR LES ÉTIQUETTES = 96 Réactifs pour 96 mesures À utiliser avant À conserver entre 2 et 8 C N de lot Pour utilisation diagnostique in vitro Mercodia 2009, 2011

3 UTILISATION PRÉVUE Le test Mercodia Adiponectin ELISA fournit une méthode de détermination des quantités d'adiponectine humaine dans le sérum ou le plasma. RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST L'adiponectine est également appelée Acrp30 (30 kda adipocyte complement-related protein), GBP28 (Gelatin-binding protein), adipoq, apm1 (Ad pose most abundant gene transcript 1) [1, 2]. L'adiponectine est une hormone secretée par les cellules adipeuses, elle se compose de 244 acides aminés d'un poids moléculaire d'environ 30kDa (de 28 à 30 kda). C'est l'une des plus abondantes protéines du sang humain, avec des concentrations de circulation de 0.5 à 30 μg/ ml, soit environ 0.01% des protéines totales du plasma [2]. La protéine se compose de quatre domaines : un domaine globulaire C-terminal, un domaine collagène de type N-Terminal, un peptide de signalement et un domaine hyper variable. Le domaine globulaire possède une séquence siginificative et des similitudes structurelles au facteur du complèment C1q [2,3]. Le domaine globulaire possède également des similitudes strucutrelles avec TNF -α [3-5]. La concentration d'adiponectine est associée inversement au diabète de type II, à l'insuffisance coronaire et à l'obésité, appartenant tous au syndrome métabolique. L'adiponectine réduit les concentrations de glucose dans le sang et d'acides gras dans le sérum, et augmente la sensibilité insulinique [7]. Il est aussi reconnu que l'adiponectine possède des effets antiinflammatoires [2]. Il est suggéré que l'adiponectine existe sous différentes formes de circulation : des monomères, des formes globulaires isolées (domaines globulaires), des trimères, des hexamères et de plus grands oligomères [8-11]. On croit que les monomères s'associent lors de la circulation aux trimères au travers des domaines globulaires. Les trimères s'associent aux oligomères, plus grands, au travers du domaine de type collagène [7]. Néanmoins, de récentes études indiquent que l'adiponectine peut se retrouver dans la circulation sous une autre forme que des monomères ou des forrmes globulaires isolées : des structures multimères. Les études ont démontré que les formes dominantes d'adiponectine qui circulent dans le sang humain sont des hexamères (BPM) et des oligomères plus grands (HPM) [6, 12-14]. Les niveaux d'adiponectine BPM semblent ne pas différer entre les sujets sensibles à l'insuline et ceux qui y sont résistants, ni ne différent entre les hommes et les femmes. Les niveaux élevés d'adiponectine totale des sujets sensibles à l'insuline et des femmes étaient causés par des quantités élevées d'adiponectine HPM. L'adiponectine totale et HPM ont montré des différences importantes entre les sujets sensibles à l'insuline et ceux y étant résistants conformément à Lara-Castro et coll [6]. Plusieurs isoformes d'adiponectine circulent dans le sang. Cela est suffisant pour déterminer si tous les isoformes sont secrétés par des adipocytes, s'il existe un ensemble post-transcriptionnel d'adiponectine HPM dans le sang ou si la forme HPM est secrétée et dégradée dans le sang. L'importance métabolique individuelle de chaque isoforme d'adiponectine reste aussi assez vague [6]. 3

4 PRINCIPE DE LA PROCÉDURE Une caractéristique du test Mercodia Adopinectin ELISA est le dosage immunologique enzymatique à double site, en phase solide. Il repose sur une technique de type sandwich direct, dans laquelle deux anticorps monoclonaux sont dirigés contre deux déterminants antigéniques distincts du adiponectine. En phase d incubation, les molécules de adiponectine de l échantillon réagissent avec les anticorps correspondants fixés aux puits de microtitration. Après rinçage, on ajoute des anticorps anti-adiponectine conjugués à la peroxydase. Après la deuxième incubation, suivie d un rinçage simple destiné à éliminer les anticorps marqués non liés, le conjugué est détecté par réaction avec la 3,3,5,5 -tétraméthylbenzidine (TMB). Pour arrêter la réaction, on ajoute de l acide. Cette solution fournit un point d évaluation colorimétrique, qui sera lu par spectrophotométrie. AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS Pour utilisation diagnostique in vitro. Aux États-Unis : À des fins de recherche uniquement. A ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic. Le contenu de ce kit et ses résidus ne doivent pas entrer en contact avec des ruminants ou des suidés. La Stop Solution de ce kit contient 0.5 M H 2 SO 4. Respectez les précautions habituell relatives à l utilisation de produits chimiques dangereux. Tous les spécimens patients doivent être traités comme des échantillons contagieux. MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI Pipettes de 20, 25, 50, 100, 200 et 1000 µl (il est recommandé d utiliser des pipettes à répétition pour l ajout du solution enzyme conjugate 1X, du Substrate TMB et de la Stop Solution). Béchers et éprouvettes cylindriques pour la préparation des réactifs Eau redistillée Lecteur de microplaques (filtre de 450 nm) Agitateur secoueur de plaques (le régime recommandé est de 700 à 900 cycles par minute, mouvement orbital) Dispositif de rinçage de microplaques 4

5 RÉACTIFS Chaque kit Mercodia Adiponectin ELISA ( ) contient suffisamment de réactifs pour 96 puits, soit une quantité permettant de traiter 42 échantillons et une courbe d étalonnage en double. Pour des séries de dosages plus importantes, mélangez les réactifs de kits portant des numéros de lot identiques. La date de péremption du kit figure sur l étiquette apposée à l extérieur. La température de stockage recommandée est 2 à 8 C Coated Plate 1 plaque 96 puits Prêt à l emploi Anti-adiponectine humaine monoclonale de souris Bande à 8 puits Les bandes de plaque de microtitration non utilisées peuvent être conservées pendant 8 semaines entre 2 et 8 C après avoir été replacées dans leur emballage hermétiquement fermé à l aide d une bande adhésive. Calibrators 1, 2, 3, 4, 5 5 flacons 1000 µl Prêt à l emploi Adiponectine humaine recombinante Code couleur : jaune Concentration indiquée sur l étiquette du flacon Calibrator 0 1 flacon 5 ml Prêt à l emploi Code couleur : jaune Assay buffer 1 flacon 12 ml Prêt à l emploi Code couleur : rouge Sample Buffer 2X 1 flacon 50 ml Diluer avec 50 ml Code couleur : jaune d'eau redistillée Stockage après dilution : pour préparer la entre 2 et 8 C pendant 8 semaines. solution de sample buffer 1X Enzyme Conjugate 11X 1 flacon 1.3 ml À préparer, Anti-adiponectine humaine monoclonale voir ci-dessous de souris conjuguée à la péroxydase Enzyme Conjugate Buffer 1 flacon 13 ml Prêt à l emploi Code couleur : bleu Wash Buffer 21X 1 flacon 50 ml Diluer avec 1000 ml Stockage après dilution : d'eau redistillée à 2-8 C pendant 8 semaines. pour rincer la solution wash buffer 1X. Substrate TMB 1 flacon 22 ml Prêt à l emploi Solution incolore Remarque! Cette solution est sensible à la lumière. Stop Solution 1 flacon 7 ml Prêt à l emploi 0.5 M H 2 SO 4 5

6 Préparation de la solution enzyme conjugate 1X Préparez le volume requis de solution enzyme conjugate 1X en diluant l Enzyme Conjugate 11X (1+10) dans l Enzyme Conjugate Buffer en suivant les indications du tableau ci-dessous. Mélangez sans agiter. Lors de la préparation de l enzyme conjugate 1X pour une plaque entière ou si les réactifs doivent être utilisés sous 8 semaines, transvasez tout le contenu de l Enzyme Conjugate Buffer dans le flacon de l Enzyme Conjugate 11X. Nombre de bandes 12 bandes 6 bandes 4 bandes Enzyme Conjugate 11X 1 flacon 600 µl 400 µl Stockage après dilution : entre 2 et 8 C pendant 8 semaines. Enzyme Conjugate Buffer 1 flacon 6 ml 4 ml COLLECTE ET MANIPULATION DES SPÉCIMENS Sérum Collectez le sang par ponction veineuse et attendez la coagulation. Séparez le sérum par centrifugation à g pendant 15 minutes entre 2 et 8ºC. Les spécimens peuvent être stockés entre 2 et 8 C jusqu'à 14 jours. Pour conserver les échantillons plus longtemps, stockez-les à une température de 20 C. Évitez de les congeler et de les décongeler plusieurs fois. Plasma Collectez le sang par ponction veineuse dans des tubes contenant de l EDTA, de l'héparine ou du citrate comme anticoagulant et isolez le plasma. Les échantillons peuvent être stockés entre 2 et 8ºC jusqu'à 14 jours. Pour conserver les échantillons plus longtemps, stockez-les à une température de 20 C. Évitez de les congeler et de les décongeler plusieurs fois. PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS Les échantillons doivent être dilués à 1/101 v/v avec le solusion de sample buffer 1X (20 μl échantillon ml solution de sample buffer 1X). Les échantillons dilués peuvent être stockés entre 2 et 8ºC jusqu'à 14 jours. Remarque! Les Buffers contenant de l'azoture de sodium (NaN 3 ) ne peuvent pas être utilisés pour la dilution de l'échantillon. 6

7 PROCÉDURE DE TEST Tous les réactifs et les échantillons doivent être mis à température ambiante avant utilisation. Préparez une courbe d'étalonnage pour chaque dosage. 1. Préparez la solution d enzyme conjugate 1X (d après le tableau de la page précédente), la solution sample buffer 1X, la solution wash buffer 1X et les échantillons. 2. Préparez un nombre suffisant de puits de microplaques pour y loger les Calibrators et les échantillons en double. 3. Pipetez 25 µl de chaque Calibrator et de chaque échantillon dans les puits appropriés. 4. Ajoutez 100 µl d Assay Buffer à chaque puits. 5. Laissez incuber sur un agitateur de plaque (700 à 900 tr/mn) pendant une heure à température ambiante (entre 18 et 25 C). 6. Lavez 6 fois avec 700 µl de solution wash buffer 1X par puits à l aide d un laveu de plaques automatique en utilisant la fonction aspiration verticale. Après le rinçage final, retournez et tapotez fermement la plaque sur du papier absorbant. N incluez pas d étape de trempage dans la procédure de lavage. Ou pour un lavage manuel : Jetez le volume réactionnel en retournant la microplaque au-dessus d un évier. Ajouter 350 µl de solution wash buffer 1X dans chaque puits. Jetez la solution de wash buffer 1X, tapotez fermement plusieurs fois sur du papier absorbant pour ôter l excès de liquide. Répétez l opération 5 fois. Évitez les trempages prolongés pendant l'étape de lavage. 7. Ajoutez 100 µl de solution d enzyme conjugate 1X à chaque puits. 8. Laissez incuber sur un agitateur de plaque ( rpm) pendant une heure à température ambiante (18-25 C). 9. Lavez comme décrit à l'étape Ajoutez 200 µl de Substrate TMB à chaque puits. 11. Laissez incuber pendant 15 minutes à température ambiante (18-25 C). 12. Ajoutez 50 µl de Stop Solution à chaque puits. Placez la plaque sur un agitateur pendant environ 5 secondes afin que le mélange s effectue correctement. 13. Lisez la densité optique à 450 nm et calculez les résultats. La lecture doit être réalisée sous 30 minutes. Remarque : pour éviter toute contamination entre le conjugué et le substrat, il est recommandé d utiliser des pipettes différentes. CONTRÔLE QUALITÉ INTERNE Les contrôles industriels comme le kit Mercodia Obesity Control ( ) et/ou les mélanges de sérums internes dont la concentration en adiponectine est d un niveau faible, moyen et élevé, doivent systématiquement être soumis à un dosage en tant qu échantillons, et les résultats doivent être portés sur un graphique quotidiennement. Il est recommandé pour un laboratoire de conserver les données suivantes pour chaque dosage : le numéro du lot du kit, les dates de dilution et/ou de reconstitution des composants du kit, les valeurs OD pour le vide des Calibrators et des contrôles. 7

8 CALCUL DES RÉSULTATS Calcul informatisé La concentration d'adiponectine est obtenue à l'aide de la réduction des données d'absorbance des Calibrators 1-5, et par comparaison avec la concentration en appliquant une équation de régression de la spline cubique Calcul manuel 1. Placez les points correspondants aux valeurs d absorbance obtenues pour les Calibrators 1-5, en fonction de la concentration d'adiponectine connue sur un papier log-log et construisez une courbe d'étalonnage. 2. Lisez la concentration des échantillons à partir de cette courbe. 3. Multipliez la concentration par le facteur de dilution. Exemples de résultats Puits Identité A 450 Conc. moy. ng/ml x101 μg/ml 1A-B 1C-D 1E-F 1G-H 2A-B 2C-D 2E-F 2G-H 3A-B Calibrator 0 Calibrator 1* Calibrator 2* Calibrator 3* Calibrator 4* Calibrator 5* Échantillon 1 Échantillon 2 Échantillon / / / / / / / / / * Concentration exacte indiquée sur l étiquette du flacon Exemple de courbe d'étalonnage La courbe présentée est une courbe de calibrage type. Ne l utilisez pas pour déterminer les 10 résultats des dosages réels. 1 OD (450 nm) OD (450 nm) 0,1 8 0, (ng/ml) Concentration (ng/ml)

9 LIMITES DE LA PROCÉDURE Comme pour tous les tests de diagnostic, le diagnostic définitif ne doit pas reposer sur les conclusions d un seul test, mais devrait être effectué par un médecin après évaluation de tous les résultats cliniques. Des échantillons manifestement hémolysés, ictériques ou lipémiques n interfèrent pas avec le dosage. VALEURS ATTENDUES La déontologie veut que chaque laboratoire établisse sa propre plage de valeurs attendues. Mercodia Adiponectin ELISA détecte l adiponectine BPM (Hexamère 230 kda) et HPM (Oligomère > 420 kda), comme déterminé par la chromatographie sur gel. Les différentes formes multimériques d adiponectine endogène ont été étudiées et isolées dans le sérum à partir d un individu sain selon une méthode se déroulant en trois étapes : la précipitation de sulfate d ammonium par échange d ions et la chromatographie par filtration sur gel. Grâce à la chromatographie par échange d ions, les protéines s accrochent à la matrice par des forces électrostatiques qui provoquent la séparation car les différentes protéines/isoformes possèdent des charges nettes totales ou des points isoélectriques différents. La colonne d échange d ions utilisée a été Mono Q 10/100GL (GE Healthcare). De la Triethanolamine buffer a été utilisée pour éluer les protéines. Il a été découvert que les isoformes d adiponectine possèdent différents points isoélectriques et patrons post-translationnels [15]. L hydroxylation de la proline et de la lysine/la glycosylation sont connues pour leur importance concernant le rassemblement des oligomères [12, 15]. Cinq pics bien distincts sont visibles lors de la séparation de l adiponectine du sérum avec la chromatographie par échange d ions, en indiquant que l adiponectine du sérum analysée présente au moins cinq patrons différents post-translationnels, qui produisent des points isoélectriques différents. Voir figure 1 ci-dessous. Les mélanges A-E ont été analysés en profondeur selon le procédé de chromatographie sur gel afin de déterminer la taille apparente des formes multimériques 500 d adiponectine. Concentration Measured mesurée concentration d'adiponectine of (ng/ml) (ng/ml) A B C D E Pool - Nombre Fraction de fraction number Figure 1. Profil d'élution de l'adiponectine du sérum à partir de la chromatographie par échange d'ions et tel qu'identifié par le test Mercodia Adiponectin ELISA. Des fractions de pic ont été combinées en A, B, C, D et E. 9

10 La chromatographie sur gel sépare les protéines selon la taille globulaire apparente. La colonne de gel de filtration utilisée est HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare). Du PBS a été utilisé pour éluer les protéines. Trois formes multimériques dominantes sont visibles lorsque l'adiponectine du sérum est séparée selon le procédé de la chromatographie sur gel, avec des tailles apparentes de 230 kda, 420 kda et > 600 kda respectivement, et interprétées comme BPM (Hexamère 230 kda) et HPM (Oligomère > 420 kda), voir la figure 2 ci-dessous kDa 800 Concentration Measured mesurée concentration d'adiponectine of (ng/ml) (ng/ml) >600kDa E Pool D C B A 230kDa Nombre Fraction de fraction number Figure 2. Profil d'élution de l'adiponectine du sérum à partir de la chromatographie sur gel et tel qu'identifié par le test Mercodia Adiponectin ELISA. Chaque mélange (A, B, C, D et E) a été analysé de manière séparée et ensemble dans un même mélange (Pool). En conclusion, l'adiponectine du sérum analysée affiche trois formes multimériques dominantes basées sur la taille, et cinq formes différentes basées sur les points isoélectriques, ou charges nettes totales. 10

11 CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES Limite de détection La limite de détection est définie en tant que capacité de détection selon la norme ISO Partie 1. La capacité de détection doit être considérée en tant que partie d une méthode de validation, plutôt que comme la concentration la plus basse pouvant être mesurée. La limite de détection est de 1.25 (ng/ml) comme déterminé par la méthode décrite dans la norme ISO11843-Partie 4. La concentration concernant les échantillons ayant une abso bance en dessous de celle du Calibrator 1 ne doit pas être calculée, mais exprimée comme inférieure ou égale à ( ) la concentration indiquée sur le flacon du Calibrator 1. Récupération La récupération après ajout donne une valeur comprise entre % (moyenne 101%). La récupération après dilution donne une valeur comprise entre % (moyenne 98%) Effet crochet Il n'existe pas d'effet crochet. Précision 1,2 Chaque échantillon a été analysé en 4 réplicats à 39 occasions différentes. L'analyse a été effectuée dans un seul laboratoire avec un seul kit et par 4 techniciens. Coefficient de variation Valeur moyenne Échantillon ng/ml % intra-dosage % inter-dosage % total dosages ISO , 2 EP-5A Reproductibilité 1,2 Chaque échantillon a été analysé en 4 réplicats à 90 occasions différentes. L'analyse a été effectuée dans deux laboratoires avec 5 kits et par 9 techniciens. Coefficient de variation Échantillon Valeur moyenne ng/ml % intra-dosage % inter-dosage % total dosages ISO , 2 EP-5A

12 Spécificité Les réactions croisées suivantes ont été constatées : C1q 0.007% TNF-α n.s ÉTALONNAGE Le kit Adiponectin ELISA est étalonné à l aide d une préparation industrielle d'adiponectine, entièrement validée et hautement purifiée. GARANTIE Les données de performance présentées dans ce document ont été obtenues lors de tests respectant la procédure indiquée. Tout changement ou modification de la procédure, non recommandé par Mercodia AB, est susceptible d affecter les résultats. Si la procédure n est pas respectée Mercodia AB décline toute responsabilité concernant les garanties exprimées, légales ou implicites, y compris la garantie implicite relative à la qualité marchande et à la conformité d usage de ce kit. Mercodia AB et ses distributeurs agréés ne sauront être tenus pour passibles de dommages indirects ou corrélatifs si la procédure décrite n est pas respectée. RÉFÉRENCES [1] PDB, Protein Data Bank: adiponectin: Q (21 oct.2005) [2] Meier U and Gressner AM (2004) Endocrine Regulation of Energy Metabolism: Review of Pathobiochemical and Clinical Aspects of Leptin, Ghrelin, Adiponectin, and Resistin. Clin Chem 50: [3] Tsao TS, Lodish HF and Fruebis J (2002) ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose metabolism. Eur J Pharmacol 440: [4] Shapiro L and Scherer PE (1998) The crystal structure of a complement-1q family protein suggests an evolutionary link to tumor necrosis factor. Curr Biol 12: [5] Bobbert T, Rochlitz H, Wegewitz U, Akpulat S, Mai K, Weickert MO, Mohlig M, Pfeiffer AF and Spranger J (2005) Changes of adiponectin oligomer composition by moderate weight reduction. Diabetes 54: [6] Lara-Castro C, Luo N, Wallace P, Klein RL and Garvey T (2006) Adiponectin Multimeric Complexes and the Metabolic Syndrome Trait Cluster. Diabetes 55: [7] Duntas LH, Popovic V and Panotopoulos G (2004) Adiponectin: Novelties in Metabolism and Hormonal Regulation. Nutr Neurosci 7: [8] Tsao TS, Lodish HF and Fruebis J (2002) ACRP30, a new hormone controlling fat and glucose metabolism. J Biol Chem 50: [9] Nakashima R, Kamei N, Yamane K, Nakanishi S, Nakashima A and Kohno N (2006) Decreased Total and High Molecular Weight Adiponectin Are Independent Risk Factors for the Development of Type 2 Diabetes in Japanese-Americans. Clin Endocrinol Metab 91:

13 [10] Hara K, Horikoshi M, Yamauchi T, Yago H, Miyazaki O, Ebinuma H, Imai Y, Nagai R, and Kadowaki T (2006) Measurement of the High-Molecular Weight Form of Adiponectin in Plasma Is Useful for the Prediction of Insulin Resistance and Metabolic Syndrome. Diabetes Care 29: [11] Nakano Y, Tobe T, Choi-Miura NH, Mazda T and Tomita M (1996) Isolation and Charactrization of GBP28, a Novel Gelatin-Binding Protein Purified from Human Plasma. J Biol Chem 120: [12] Bodles AM, Banga A, Rasouli N, Ono F, Kern PA and Owens RJ (2006) Pioglitazone increases secretion of high-molecular-weight adiponectin from adipocytes. Am J Physiol Endocrinol Metab 291:E1100-E1105 [13] Halperin F, Beckman JA, Patti ME, Trujillo ME, Garvin M, Creager MA, Scherer PE and Goldfine AB (2005) The role of total and high-molecular-weight complex of adiponectin in vascular function in offspring whose partents both had type 2 diabetes. Diabetologia 48: [14] Fisher FF, Trujillo ME, Hanif W, Barnett AH, McTernan PG, Scherer PE, and Kumar S (2005) Serum high molecular weight complex of adiponectin correlates better with glucose tolerance than total serum adiponectin in Indo-Asian males. Diabetologia 48: [15] Wang Y, Lu G, Wong WP, Vliegenthart JF, Gerwig GJ, Lam KS, Cooper GJ and Xu A (2004) Proteomic and functional characterization of endogenous adiponectin purified from fetal bovine serum. Proteomics 4:

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16 RÉSUMÉ DU PROTOCOLE Mercodia Adiponectin ELISA Ajoutez les Calibrators et les échantillons 25 µl X-O Graf Tryckeri AB Ajoutez l Assay Buffer 100 µl Laissez incuber Rincez la plaque avec la solution wash buffer 1X 1 heure à C sur un secoueur de plaque 6 fois Ajoutez la solution enzyme conjugate 1X 100 µl Laissez incuber Rincez la plaque avec la solution wash buffer 1X 1 heure à C sur un secoueur de plaque 6 fois Ajoutez le Substrate TMB 200 µl Laissez incuber Ajoutez la Stop Solution Mesurez A minutes à C 50 µl Agitez pendant 5 secondes pour effectuer un mélange correct. Évaluez les résultats Version 4.0