architecture Composition structure cellulaire Échanges renouvellement Frottis vaginal Papanicolaou x800 Tissus conjonctif hématéine / éosine

Transcription

1

2 Composition structure cellulaire Frottis vaginal Papanicolaou x800 Échanges renouvellement Tissus conjonctif hématéine / éosine architecture Épithélium exocol x128 APS

3 Types d étude Cellules vivantes Celld.com viabilité bleu trypan Cellules entières fixées Culture cellulaire CHU Angers MGG Coupe de tissus après fixation et inclusion Histologie MEDSI coloration APS Futura sciences neurones dopaminergiques vert différenciés à partir de cellules souches en rouge

4 1- prélèvement Autolyse cellulaire rapide signes de souffrance cellulaire maintien de l architecture tissulaire prélèvement Biopsie Pièces opératoires exérèse

5 2-la fixation * Stabilisation des tissus le fixateur provoque la formation d un réseau intermoléculaire stabilisé par des liaisons covalentes * maintien des caractéristiques physico-chimiques et d organisation pas blocage des groupements chimiques particuliers qui pourraient faire l objet d une coloration histochimique

6 Fixation physique La congélation - 20 à -180 C empêche l autolyse durcit le prélèvement coupe rapide possible meilleur système pour une biopsie La cryodessiccation congélation et évaporation complète sous vide utile lors de la recherche de petites molécules facilement hydrolysables dans le tissus

7 fixateurs chimiques: L éthanol: fixe les glucides mais solvant des lipides. Durcit les tissus. Utilisé pour les frottis mais non pour les pièces histologiques. Le formol (formaldéhyde=méthanal en solution aqueuse): ponts méthyléniques inter et intraprotéines, blocage de la cytolyse tue les éventuelles bactéries qui pourraient dégrader le tissu. Bon pouvoir de pénétration. Manipulation précautionneuse (risques pour l utilisateur: irritation des muqueuses ). Utilisé pour les pièces histologiques, convient pour celles de grande taille. Le Liquide de Bouin: mélange de formol, d acide picrique en solution dans l eau ou l éthanol (coagulation des protéines) et d acide acétique (bon fixateur nucléaire, mais altère collagène et mitochondries). Utilisé pour les pièces histologiques, de petite taille préférentiellement en première intention (pénétration lente). Convient à la microscopie optique uniquement. Liquide de Carnoy: mélange d alcool + chloroforme + acide acétique. Fixe bien les noyaux. Utilisé pour les très petites pièces histologiques. L acide osmique (OsO 4 ): stabilise bien les lipides mais perte de 20% des protéines. Utilisé pour les tissus nerveux surtout, convient à la microscopie électronique

8 Préparer le fixateur en milieu tamponné. Un volume correspondant à 50x celui de la pièce à fixer est nécessaire. Prélever l échantillon par biopsie ou dissection, le laver à l eau physiologique (NaCl à 9g/L d eau stérile, pas d éclatement des cellules). Couper en tranche de 5 mm à 2 à 3 cm. Immerger rapidement dans le fixateur. Identifier le flacon, le fermer hermétiquement et laisser de quelques heures à plusieurs jours. Rq: un colorant (éosine ) peut être ajouté au fixateur pour repérer les petites pièces. Les organes prélevés (ovaires à gauche et testicules à droite) sont fixés par un bain dans le liquide de Bouin. Photo F Jauzein INRP

9 Le rôle du technicien/du médecin dans l étape d analyse des pièces histologiques Autolyse cellulaire rapide => passer rapidement à l étape suivante.

10 Les échantillons sont décrits macroscopiquement puis des fragments à étudier au niveau histologique sont préparés. Les fragments d organe doivent être orientés par rapport à la pièce initiale Les tissus doivent être découpés proprement pour maintenir l architecture tissulaire.

11 Étape préalable à l inclusion 3 la déshydratation/ permet de chasser l eau des tissus et de préparer ainsi le remplacement par des produit hydrophobes se fait par passages successifs dans des bains d alcool de degré croissant (10 heures) substitution la clarification: bain de toluène solvant de l alcool absolu et de la paraffine (3 heures)

12 4- inclusion/ imprégnation Permet d obtenir des pièces rigides autorisant une coupe fine 2 à 10 µm pour la microscopie optique le produit d inclusion va remplacer l eau des tissus mélange d hydrocarbures hydrophobes ex: paraffine

13 Passage à l étuve à 56 C 4 heures

14 5- La coupe Réalisation de coupes de 1 à 25µm en général, autorisant l observation en microscopie. Préparation du bloc de paraffine:

15 Le microtome

16 Ruban de coupes

17 Objectif: Fixer les coupes sur des lames de verre. Eviter toute cassure, tout pli. Protocole: 6- le collage -Goutte d une solution de collage = d étalement (albumine dans l eau, albumine glycérinée ou eau gélatinée) sur la lame. -Placer une bonne coupe sur la lame face brillante contre le verre. -Lame déposée sur une plaque chauffante => la paraffine ramollit sans fondre => déplissage. -1 à 2h dans une étuve à 37 C => évaporation de l excédent d eau.

18

19

20 7- déparaffinage et Il faut éliminer la paraffine ( hydrophobe) pour rendre les tissus perméables aux colorants ( solutions aqueuses ou alcooliques) technique: des bains successifs de xylène puis d alcools de degré décroissant jusqu à l eau courante réhydratation

21 8- la coloration

22 La coloration à l APS acide périodique -Schiff Objectif: coloration des glucides de réserve ( glycogène amidon), glucides de soutien, mucoplosaccharides (chaînes d hexosamines des sécrétions visqueuses), glycolipides et glycoprotéines principe 1 temps : oxydation par l acide périodique des polysaccharides ( formation des aldéhydes) 2 temps : réaction des aldéhydes avec le réactif de Schiff ( fuchsine décolorée) coloration rouge-violacée

23 APS x320 glande endocrine folliculaire thyroïde

24 Structures colorées par l APS: 1- Mucus des cellules caliciformes. 2- Glycoprotéines et mucopolysaccharides recouvrant les microvillosité des entérocytes. Épithélium d une villosité intestinale x320.

25 Villosité intestinale x320 HE APS/hématoxyline ferrique/orange G

26 La coloration HE hémalun éosine ( safran) coloration trichromique coloration par hémalun,coloration progressive, noyaux bleus coloration par l éosine, coloration régressive, cytoplasmes roses coloration par le safran ou l orange fibres de collagène orange

27 HE épiderme x100

28 Jonction dermo-épidermique, coloration HES x320

29 Le trichrome de Masson Coloration trichromique: -Coloration en bleu sombre des noyaux par l hémalun. -Coloration en rouge-rosé des cytoplasmes par le ponceau-fuschine. -Coloration en bleu-vert des fibres conjonctives par le bleu d aniline. Jonction dermo-épidermique, peau du doigt face palmaire, trichrome de Masson.

30 Coloration Composants Cytoplasme Collagène Élastine ADN Autres Hémalun- Eosine Hématoxyline, érythrosine (safran) rouge/rose rouge/rose jaune) rouge bleu/ noir van Gieson Hématoxyline, fuchsine et acide picrique jaune rouge - (parfois rose) noir Goldner Hématoxyline, acide de fuchsine, Lichtgrün rouge vert - noir Elastica Résorcine, fuchsine brun-violet Azan Azocarmine, bleu aniline rouge bleu - (parfois rose) rouge Ladewig Orange G, méthylblue, fuchsine acide, hématoxyline rouge (érythrocyte orange) bleu noir Sudan III Colorant soluble dans les lipides Lipides en orange PAS Hématoxyline, acide periodique, réactif de Schiff bleu Polysaccharides : violet-rouge Trichrome Masson Hématoxyline, ponceau / fuchine, bleu d aniline rose bleu Bleu/ noir Nissl Thionine (ou toluidine ou violet de crésyle) bleu (avec le RE) bleu

31

32 9 - la déshydratation Étape préalable au montage avec des produits de type hydrocarbure

33 10 - le montage Recouvrement de la préparation par une lame protectrice en utilisant une «colle» le baume ou résine de montage pour une conservation longue on utilise le baume du Canada ou l Eukitt indice de réfraction proche du verre baume verre 1.52 huile à immersion 1.516

34

35 archivage

36