Réplica9on de l ADN. Aver9ssement

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1 UE 1B-biomolécules, génome, bioénergé9que, métabolisme, méthodes d étude et analyse du génome II-le génome : sa structure, son expression Organisa9on, évolu9on et fonc9on du génome humain Année Réplica9on de l ADN Dr Annie M. Bérard Pr Nicolas Sévenet 1 Aver9ssement Certaines images de ce cours sont 9rées de livres et d ar9cles de journaux scien9fiques et couvertes par le copyright. Pour la plupart, elles peuvent être u9lisées pour l enseignement comme l illustra9on d un cours, mais ne peuvent pas être reproduites sans autorisa9on. En conséquence ce fichier est à usage exclusivement personnel. 2 1

2 Réplica9on de l ADN : plan du cours I. Caractéris9ques générales a) Phase S b) Processus semi-conserva9f II. Étapes de la réplica9on a) Ini9a9on b) Élonga9on-polymérisa9on III. Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes a) Polymérases b) Télomères et télomérases c) Nucléosomes d) ADN mitochondrial 3 I- Caractéris9ques générales a) Phase S Réplica9on C est une nécessité AVANT la division cellulaire (mitose) Elle a lieu une seule fois au cours du cycle cellulaire, en phase S La réplica9on perpétue l informa9on géné9que Elle assure donc le main9en de l intégrité de l informa9on géné9que 4 2

3 I- Caractéris9ques générales b) Processus semi-conserva9f Réplica9on Processus semi-conserva9f : Chaque molécule fille d ADN conserve un brin parental Brin parental 1 Brin parental 1 Brin parental 2 Brin néosynthé9sé 2 Brin néosynthé9sé 1 Brin parental 2 ADN bicaténaire parental ADN bicaténaire néo-synthé9sés Alberts et coll. Fig

4 radient de chlorure de césium Expérience de Meselson-Stahl (1958) 7 Une explica9on illustrée de l expérience de Meselson et Stahl hep:// 8 4

5 a) ini9a9on Origines de réplica9on Caractéris9ques Lieu de modifica9on de la torsion de l ADN par des protéines Séquences spécifiques d ADN (quelques centaines de nucléo9des) Sites de fixa9on de protéines Phase 1 Reconnaissance des Origines de Réplica9on fixa9on du complexe ORC (Origin Recogni+on Complex) + CDT1 + CDC6 Fixa9on du complexe MCM (minichromosome maintenance proteins) à ac9vité hélicase L ensemble forme le complexe de pré-réplica9on qui reste inac9f jusqu à l entrée en phase S 9 Etapes préliminaires à la synthèse de brins complémentaires Figure R4 Complexe MCM Formation du complexe de pré-réplicaton 10 5

6 a) ini9a9on Phase S Dégrada9on de CDT1 et élimina9on de CDC6 Ouverture de la chaine double brin : hélicase Rupture des liaisons hydrogène maintenant les bases appariées deux à deux Stabilisa9on des brins séparés par RP-A (Replica9on Protein A) et/ou SSB single strand binding proteins Fixa9on de l ADN polymérase α (Polα) Synthèse de l amorce ARN-ADN (ARN polymérase-adn dépendante) Ac9vité primase Ac9vité ADN polymérase Détorsion de la chaîne : topoisomérases 11 Hélicase Hexamère avec orifice central pour ADN monocaténaire Progression par hydrolyse d ATP sur de l'adn simple brin Alberts et coll. Fig

7 Figure R5 Formation du complexe de réplication et formation d une fourche de réplication 13 Primase Primase ARN polymérase ADN dépendante Matrice d'adn, Pas d'amorce, rntp, Allonge de 5' vers 3' Amorce (ARN) Primase Alberts et coll. Fig

8 Figure R6 L ouverture du double brin d ADN création de super tours en amont 15 Figure R7 25 ans plus tard // exp de MS : découverte des topoisomérases Eucaryotes : -Coupure d un brin de l ADN -Passage à travers le trou de l autre brin d ADN -Ligature par une topoisomérase (Euc : I, II) Ex action topoisomérase = détorsion des spires d ADN 16 8

9 b) Élonga9on-polymérisa9on Déroulement de l ADN des nucléosomes Décompac9on des super-tours néga9fs : topoisomérases I, II Mise en place de la fourche de réplica9on Reconnaissance du complexe matrice-amorce Remplacement de la Polα par δ ou ε 2 Polymérases par9cipent à l élonga9on : synthèse ADN complémentaire à par9r de l amorce ARN ADN pol δ : élonga9on du brin principal. Fixa9on grâce au PCNA. Elle possède une ac9vité de correc9on ADN pol δ ou ε : sur le brin secondaire, forma9on des fragments Okazaki mais plusieurs fragments formés 17 3 La fourche de réplica9on Le complexe de réplica9on (simplifié) Brin ancien Avancée du complexe Brin nouveau ADN Polymérase 3 3 Clamp PCNA Fragments d Okazaki Amorce Primase Hélicase Protéines SSB Alberts et coll. Fig 5-28 Polymérase Chargeur de clamp = RF-C Disposi9on asymétrique 18 9

10 Figure R10 ADN polymérases : α, δ Brin néosynthétisé dntp amorces ARN Brin parental 3 Fourche de réplication Fragments d Okazaki Direction de la fourche de réplication Brin parental Dr A. Bérard, PACES Figure R11 Brin continu / direct / précoce F1 F2 Brin discontinu / indirect / tardif ou retardé (longueur brin = 100 à 200 bases) F3 3 Amorce 20 10

11 La synthèse est semi-discon9nue Au niveau de chaque fourche de réplica9on - Brin con9nu (direct, précoce) : la synthèse s effectue dans le même sens que la propaga9on de la fourche (synthèse -3 ) - Brin discon9nu (indicrect, tardif, retardé) : la synthèse s effectue en sens inverse de la propaga9on de la fourche à fragments d OKASAKI - Fourche de réplica9on asymétrique 21 La synthèse est semi-discon9nue Allongement FAUX! 22 11

12 La synthèse est semi-discon9nue Allongement VRAI! 23 b) Elonga9on-Polymérisa9on Forma9on et allongement d un nouveau brin d ADN (brin néosynthé9sé) Par fixa9on des désoxyribonucléosides triphosphates les uns aux autres Dont l ordre est défini selon un brin modèle (matrice, parental) par complémentarité des bases (A=T; C) Le brin nouveau est synthé9sé toujours dans le sens -3 Le brin matrice (modèle, parental) est «lu» dans le sens 3 - Les deux brins (néo-synthé9sé et parental) sont an9-parallèles La polymérisa9on concerne donc les brins en cours de synthèse Elle est catalysée par une ADN polymérase (ADN-dépendante) 24 12

13 b) Elonga9on - Polymérisa9on Complémentarité des bases 25 La polymérisa9on s effectue TOUJOURS dans le sens -3 Brin matrice 3 - Sens de lecture 3-3 C T A T C Brin néosynthé9sé -3 C A P P P OH 3 P P P T OH La polymérisa9on est unidirec9onnelle 3 C T A T C C A T P P P Sens de synthèse -3 P OH 3 P P 26 13

14 Figure R12 27 La réplica9on est bi-direc9onnelle O = origines de réplica9on R = réplicons Temps Photographie en microscopie électronique d un brin d ADN en cours de réplica9on hep://ludwig-sun1.unil.ch/~vjongene/molbio/chapt_6.htm Fourches de réplica9on 28 14

15 Figure R11 Brin continu / direct / précoce F1 F2 Brin discontinu / indirect / tardif ou retardé (longueur brin = 100 à 200 bases) F3 3 Amorce 29 Élonga9on du brin discon9nu Fragments d Okazaki ADN Pol δ ADN Pol δ 30 15

16 ADN ligase Fragments d Okazaki Amorces (Primase) 3 3 Nouveau brin (ADN polymérase) Raboutement des fragments d'okazaki 31 Figure R13 Comblement des brèches + action ADN ligase pour lier C à 3 3 Schéma Dr A. Bérard, PACES 16

17 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes a) Polymérases ADN pol α β δ ε γ Sous-unités 4, dont primase et polymérase Localisa9on Nucléaire Nucléaire Nucléaire Nucléaire Mitochondriale Fonc9on Réplica9on BER Réplica9on BER, NER Réplica9on BER, NER Réplica9on et répara9on Ac9vité exonucléase Processivité faible faible non non oui oui oui élevée (PCNA) élevée (PCNA) élevée Fidélité élevée faible élevée élevée élevée 33 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases Les télomères : Fragments terminaux des chromosomes. Extrémité 3 plus longue Non codants mais servent à maintenir l intégrité du matériel géné9que. Séquences répé99ves en tandem riches en : TTA 3 3 C A T A T T A C C C T T A A T T Repliement en épingle du fragment 3 simple brin protection contre les DNases T T A A T T 34 17

18 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases Importance des télomères La réplica9on exige une amorce d ARN qui est ensuite dégradée et non remplacée la réplica9on des extrémités des chromosomes est incomplète perte de 50 à 200 nucléo9des par cycle 35 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases La longueur des télomères est le reflet du nombre de mitoses à horloge du vieillissement cellulaire 30 mitoses 10 mitoses 10 mitoses Sénescence : Cellule vivante, métaboliquement ac9ve mais absence de division 36 18

19 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérases Il y a une érosion des télomères si pas d ac9vité télomérase Phénomène normal dans l organisme adulte Sénescence et mort cellulaire (télomères < 5-6 kb) Horloge du vieillissement cellulaire Prévient les phénomènes cancéreux Ac9vité télomérase (synthèse de télomère) lors de l embryogenèse, les mul9plica9ons cellulaires sont massives mise en place d une ac9vité de main9en des télomères Après la naissance diminu9on et perte de ceee ac9vité sauf dans certaines cellules : cellules souches adultes, cellules germinales Pathologies : les cellules cancéreuses (sur)expriment les télomérases (facteur d immortalité) Les télomères sont donc re-synthé9sés par une transcriptase inverse : la télomérase 37 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérase La télomérase : synthèse des télomères Cons9tuée de 2 sous-unités d une sous-unité cataly9que (htert) : ribonucléoprotéine, transcriptase réverse spécialisée d un ARN-matrice qui présente la séquence complémentaire AATCCC (htr) Stabilise les télomères en ajoutant des séquences TTA aux extrémités des chromosomes : compense le raccourcissement télomérique lié aux mitoses. Élonga9on du télomère à par9r d une matrice de ARN incluse dans la télomérase

20 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérase ARN structurel Doigts Télomérases = Enzymes riboprotéiques = Sous-unité protéique + cœur cataly9que ARN ARN guide Paume Alberts et coll. Fig 5-42 ADN allongé Pouce 39 III- Par9cularités de la réplica9on de l ADN chez les eucaryotes b) Télomères et télomérase 3 Allongement de l extrémité 3 par recopiage de «l amorce» d'arn interne Télomérase Alberts et coll. Fig 5-43 ADN polymérase 40 20

21 No9on de base Quan9té d ADN nucléaire en fonc9on du cycle cellulaire 4c chroma9des = 92 chroma9des 2n chromosomes = 46 chromosomes à 2 chroma9des 2c chroma9des = 46 chroma9des 2n chromosomes = 46 chromosomes à 1 chroma9de Voir cours UE2 Chroma9ne et Chromosomes & Contrôle moléculaire du cycle cellulaire 41 Figure R15 : Redistribution des nucléosomes pendant la réplication 21

22 Réplica9on de l ADN mitochondrial Mitochondries Organites auto-réplica9fs Taille de bp ( fois plus pe9t que génome nucléaire) énome circulaire (brins H, L complémentaires) Réplica9on du génome mitochondrial Relâchement de l ADN par des topoisomérases 2 origines de réplica9on bien définies (orih, oril) Pas de fourche de réplica9on Réplica9on unidirec9onnelle des 2 brins dans des direc9ons opposées Super enroulement par des gyrases 43 Réplica9on de l ADN mitochondrial h8p://molbiol4masters.masters.grkr aj.org/html/ Eukaryo+c_DNA_Replica+ on6- Replica+on_of_Organelle_ DNA.htm 44 22

23 Conclusion Régula9on de la réplica9on permet une réplica9on fidèle Dérégula9on à accumula9on progressive de muta9ons génomiques/ chromosomiques/ponctuelles à proliféra9on cellulaire non contrôlée à cancer Cibles thérapeu9ques à inhiber la réplica9on de l ADN Inhibiteurs de topoisomérases Agents intercalants à inhibiteurs de la dépolymérisa9on de la tubuline Agents alkylants (dérivés du pla9ne) 45 23