Lipoplexes: l exemple des ARN interférents

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1 Académie de Pharmacie le 5 février 2014 Des médicaments intelligents: L Alliance de la Chimie et de la Biologie Lipoplexes: l exemple des ARN interférents Daniel Scherman daniel.scherman@parisdescartes.fr

2 Principe de la thérapie génique Nucléotide thérapeutique + Vecteur d administration Effet thérapeutique (usuellement par gain de fonction) Virus recombinant défectif ADN plasmidique bactérien + Vecteur chimique : lipide ou polymère cationique Technique physique d administration

3 200 nm Le plasmide, principe thérapeutique Les ARN interférents: oligonucléotides de synthèse, modifiés, double brins, bp

4 ADN et ARNi Polymères poly-anioniques Intéragissent de façon coopérative avec les polycations: Avec des polymères (polylysine, polyethyleneimine) => polyplexes avec des lipides cationiques=> lipoplexes Interaction avec la membrane plasmique et internalisation cellulaire

5 3 Endocytosis or Membrane crossing (fusion)? 1 Particle formation 2 Access to cell membrane & Adhesion? Cationic lipid or polymer + Plasmid 4 Intracellular Trafficking (avoid degradation)??? 5 Nuclear import or Nuclear segregation during mitosis 6 Transcription Traduction Product secretion

6 Structure des lipides cationiques Polar head Positively charged (amine, guanidine, imidazole ) Spacer Hydrophobic entity Acyl chains cholesterol DOTAP DMRIE DOTMA DOSPA BGTC DC-Chol

7 Lipides cationiques RPR Tête polaire linéaire H 2 N H N N H N H H O N N O NH 2 RPR Tête polaire globulaire H 2 N N H N O N H O N

8 Formation des lipoplexes ADN Liposome Micelle

9 +NH 3 N N H N O N H 2 + O N+ H 3 Lipopolyamine, tête polaire globulaire, C14 Cationic lipid Neutral lipid Liposome Multilamellar structures TEM Plasmid DNA Lipoplex

10 Diameter (nm) Fluorescence intensity (a.u.) Zeta potential (mv) Lipoplexes d ADN Charge ratio C Gel retardation (Electrophoresis) Particle size (light scattering) Nucleic acid compaction (Ethidium Bromide exclusion) Surface charge (z potential) Charge ratio (Cationic lipid /DNA) (+/-) Charge ratio

11 A C B D Influence du cycle cellulaire sur l efficacité des lipoplexes E

12 Influence du cycle cellulaire Les cellules quiescentes post-mitotiques sont: - non compétentes pour l utilisation des lipoplexes - ou très inefficaces : 95% de perte de l efficacité de transfection

13 Allovectin: lipoplexe HLA-B7 et ß2 microglobuline Vical arrête l essai Allovectin d immunothérapie du mélanome après l échec de la phase III.

14 Depuis les années 2000: Renaissance des lipides cationiques comme agents d administration d ARNi

15 Exportin- 5 ARN interférence Drosha DGCR8 pre-mirna mirna Dicer unwinding loading chromosome ORF AAAAAAAA RISC pri-mirna NO PROTEIN shrna Expression vector shrna ORF AAA Cloned in an expression vector Dicer sirna RISC Exportine-5 Delivery system sirna sirna transfection

16 Formation de lipoplexes Cationic lipid Neutral lipid Liposome sirna : small double-stranded RNA, 21-nt pdna : large double-stranded circular DNA, nt Multilamellar structures TEM sirna? Lipoplex

17 Diameter (nm) Fluorescence intensity (a.u.) Zeta potential (mv) Lipoplexes ARNi Charge ratio Gel retardation (Electrophoresis) C Particle size (light scattering) Nucleic acid compaction (Ethidium Bromide exclusion) Surface charge (z potential) Charge ratio (+/-) Charge ratio (Cationic lipid /sirna) (+/-)

18 Effet négatif des protéines anioniques du sérum pour l interférence ARN médiée par les lipoplexes Inhibition (%) Charge ratio nmoles cationic lipid / µg nucleic acid Viabi 100 Cellular viability sirna transfection serum - serum + serum - serum + serum - serum sirna (nm) Inhibition of luciferase on B16-Luc cells No inhibition with sirna control sirna (nm) + cargo 1/1 (w/w)

19 ARNi Petits oligonucléotides (25 bp) Faible interaction ionique avec les polycations Faible stabilité des lipoplexes Désaggrégation en présence de sérum

20 But et hypothèse But: Augmenter la stabilité des lipoplexes ARNi/lipid cationique En présence de serum Hypothèse : Supplémenter avec un polyanion polymérique jouant le rôle de «liant» des lipoplexes APIRL: Anionic Polymer Interfering RNA Lipoplexe

21 % inhibition dsdna-apirl Quantité croissante d ADN non codant «cargo» Cationic lipid Neutral lipid Liposome nM sirna Charge ratio 4 In the presence of serum 5% No inhibition with sirna control Luciferase inhibition Cellular viability sirna DNA cargo Lipoplex 0 1/0 1/0.5 1/1 1/2 1/4 Ratio sirna / cargo (w/w)

22 Diameter (nm) Fluorescence intensity (a.u.) Zeta potential (mv) dsdna-apirl lipoplexes Multilamellar structures TEM Charge ratio S P Charge ratio (+/-) Charge ratio (Cationic lipid /sirna+dna) (+/-) Rhinn et al, Biophysica Biochimica Acta, 2009

23 dsdna-apirl en présence de sérum sirna lipoplexes (sirna + DNA glue) lipoplexes Inhibition (%) Charge ratio serum - serum serum - serum sirna (nm) sirna (nm) + DNA glue1/1 (w/w)

24 Inhibition (%) Principe général indépendant du lipide cationique 100 sirna sirna + DNA glue serum lipopolyamine liposome DMRIE-C lipopolyamine micelles Lipofectamine sirna transfection Inhibition of luciferase on B16-Luc cells No inhibition with sirna control Rhinn et al, Biophysica Biochimica Acta, 2009

25 dsdna-apirl in vivo

26 Clinical score Clinical score Modèle d arthrite au collagène Souris i.v. normal arthrite µg sirna (0.5 mg/kg), 3/week, iv sirna anti TNFa PBS sictle + lipid sitnf + lipid (sitnf + DNA) + lipid Methotrexate * ** *** Days following arthritis induction No toxicity No induction of INF production µg sirna (0.5 mg/kg), 1/week, iv Cocktail of sirn Days following arthritis induction * ** * ** * DNA cargo lipoplexes sictle siil-1 siil-18 siil-6 Khoury et al, Arthritis & Rheumatism, 2006, 2008 PBS si(il1/il18/il6)

27 Utilisation i.v. de dsdna -APIRL Pour l identification de gènes candidats dans l inflammation polyarthritique In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Courties et al., Blood. 2010, 116: Lipid nanoparticles for sirna delivery in lungs. Trichet V, Layrolle P, Escriou V. Nanomedicine (Lond). 2012, 7: Cytosolic phospholipase A2α gene silencing in the myeloid lineage alters development of Th1 responses and reduces disease severity in collagen-induced arthritis. Courties G et al. Arthritis Rheum. 2011, 63: Divergent effects of endogenous and exogenous glucocorticoid-induced leucine zipper in animal models of inflammation and arthritis. Ngo D, et al. Arthritis Rheum. 2013, 65: Nicotinamide phosphoribosyltransferase/visfatin expression by inflammatory monocytes mediates arthritis pathogenesis. Présumey J et al., Ann Rheum Dis. 2013, 72:

28 Mécanisme ARNi fluorescent détécté dans les macrophages activés des articulations APIRL capturé par des monocytes circulants Ou? APIRL ciblé vers les zones inflammatoires Meilleure stabilité in vivo dans la circulation sanguine Meilleure biodistribution

29 Administration locale: Modèle d ostéosarcome BLI fold change (J5/J7) 1 - Optimisation of sirna delivery with siluc and bioluminescence imaging Osteosarcoma-Luc cells * * * * i.t. injection of lipoplexes 2.5 µg sirna (0.125mg/kg) tumor In vivo bioluminescence (BLI) BLI BLI BLI * * * lipoplex (sirna + DNA) Days { Specific Luc inhibition Without side effect on tumor growth sictle siluc Coll. F. Rédini, V. Trichet, U957, Inserm, Nantes Rousseau et al, Cancer Gene Therapy, 2010 * p<0.05

30 Tumor volume (mm3) Anti RANKL sirna en combinaison avec l ifosfamide Luc-Pos-1 tumor Ifosfamide 60mg/kg * * * Then: 1 sequence of treatment (ifosfamide + lipoplex) / week during 5 weeks lipoplex (sirna + DNA) Significant slowdown of tumor progression 3000 (as early as day 10) vehicle vehicle sictle sirankl + ifosfamide Prevention of para-tumoral osteolytic lesions Ifosfamide Normal bone Vehicule sictle sirankl ** ** ** *** ** ** Days following osteosarcoma transplantation Rousseau J, et al, J Bone Miner Res. 2011

31 Adjuvants polyanioniques pour l administration d ARNi chez l homme Polyglutamate Alginate dsdna Schlegel A et al, J Control Release. 2011, 152:

32 Conclusion Développement du système APIRL: Caractérisé Efficace in vitro et in vivo Indépendant de la séquence d ARNi Cocktail d ARNi Efficace sur modèles pathologiques in vivo Outil puissant de validation de cibles Applications thérapeutiques?

33 Thanks to Acknowlegments Céline Largeau Anne Schlegel Michel Bessodes Pascal Bigey Maroun Khoury Gabriel Courties Florence Apparailly U844 Inserm - Montpellier U1022 Inserm UMR8151 CNRS Paris Julie Rousseau Valérie Trichet Françoise Rédini U957 Inserm - Nantes