L1 Travaux Pratiques de Biochimie

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1 L1 Travaux Pratiques de Biochimie Notation des TP de l unité BIO3 Les TP sont obligatoires. Toute absence devra être justifiée auprès de Mme Azou La note de TP compte pour 15% de la note finale de UE de Biochimie La note est composée de deux parties, de rapport 50/50 : 1) Une note de contrôle continu correspondant à une interrogation écrite de 10 min, faite au début de la séance de TP. Les questions posées ont trait au TP et sont abordées dans le polycopié, d'où l'importance de la lecture du polycopié avant de venir en TP. N'essayez pas de retenir les détails pratiques de l'expérimentation (volumes, par exemple), mais réfléchissez sur le principe, le rôle de chaque étape, le mode d'action de chacun des produits utilisés.- Exercez-vous à faire les calculs (dilutions, préparation de.solution à X%...) 2) Un rapport de TP rédigé, pour les étudiants de SV, suivant les consignes définies pour le traitement de texte, tableaux et figures, en unité «Passeport Informatique». Pour les étudiants de PCH/CHI, BIM le rapport sera tapé à l ordinateur avec un programme de traitement de texte au choix de l étudiant. Pour toutes les filières suivant BIO3 ce rapport devra être rédigé et rendu suivant les consignes précisées ci-dessous. Consignes de sécurité et d hygiène : Venez avec une blouse, le port de la blouse est fortement obligatoire. Vous allez manipuler des produits chimiques et biologiques, il est donc nécessaire de vous laver les mains à la fin de la séance de TP. Pour les mêmes raisons, il est interdit de manger, boire ou fumer dans les salles. Venez avec règle, crayon, de préférence HB ou 4B (nécessaire pour écrire sur la plaque de cellulose) mais aussi machine à calcul, gros feutre indélébile pour écrire sur du verre (type Pentel Pen N50). 1

2 Consignes générales à la rédaction d un rapport de travaux pratiques: Le TP comprend deux parties (dosage et chromatographie) ; vous ne rédigerez de rapport que sur l'une des deux parties (soit dosage, soit chromatographie). Les enseignants de TP vous dirons, à chaque séance, quelle partie vous rédigerez. Le rapport sera remis à Mme Roberte QUASP (4 è étage TPR II) au plus tard le 27 novembre. Vous rédigerez un seul rapport par binôme de TP La longueur du rapport sera de trois pages A4, courbes et tableaux compris. Le rapport comportera obligatoirement les parties suivantes et dans cet ordre : - un titre - le nom des auteurs ainsi que leur adresse électronique à l université de la méditerranée (@etumel.fr) - Cinq, voire six, mots clés résumant les molécules, macromolécules, gènes, cellules étudiés et techniques utilisées. - une partie «résumé» de 3 à 4 lignes ou sera exposé très brièvement le but du TP, la ou les techniques principales utilisés et les résultats. - une partie «Introduction» correspondant à une présentation générale des molécules, macromolécules, gène etc étudiés en TP (ou de techniques dans le cas de compte rendu de TP très simple). Vous rechercherez des informations, afin de présenter ces macromolécules (ou les techniques) en élargissant par rapport à ce que vous avez vu en TP. Cependant cette introduction doit toujours être en rapport avec les molécules ou les techniques que vous avez étudiées en TP. Attention au copié collé sans queue ni tête, ou trop long, à partir du Web. - une partie «Résultats», dans laquelle vous présenterez les résultats sous forme de tableaux, diagrammes, figures. Chaque figure, diagramme ou tableau devra être numérotés, avoir un titre et être légendés. Si nécessaire les résultats seront regroupés en chapitre avec un titre de chapitre. - une partie «Conclusion», dans laquelle vous conclurez sur la base des résultats obtenus, avec le cas échéant une analyse critique des résultats (ne pas se désespérer dans le cas de manipulations qui n ont pas marché cela permet de faire une analyse critique). 2

3 - une partie «Matériel et méthodes» Matériels : les solutions utilisées, leurs concentrations, les volumes, le matériel Méthodes : les techniques utilisées et le principe de ces techniques. Attention la présentation est forcément différente de celle du polycopié car le propos n est pas le même, donc il ne s agit pas de faire un copié collé du polycopié! Sur chaque page devra apparaître un en-tête reprenant le titre du TP, ainsi qu'un pied de page contenant la numérotation des pages. Une feuille de bilan, à compléter au cours de la séance, vous sera fournie en début de TP. Ce bilan est personnel et peut être corrigé à votre demande. Organisation des TP de Biochimie structurale dates 22 octobre heure s Group es 23 octobre 2 novembr e 5 novembre 13h h30-18h30 18h novembr e 8-13 Le TP comporte 2 parties : Une chromatographie d'acides aminés, Un dosage de tyrosine Les TP se déroulent au Département de Biologie dans le bâtiment TPR II (bâtiment de la scolarité) au 4 e étage salle 5 (au fond du couloir à gauche) Attention les TP durent 5h donc 13h30-18h30 ou 8h-13h 3

4 Le nombre de places étant limité dans la salle de TP, les étudiants sont tenus de respecter le jour où leur groupe de TD est convoqué en TP. Distribution des polycopiés au département de Biologie - 4 e étage du bâtiment TPR II, au secrétariat de Mme Roberte GUASP (1 er bureau après l ascenseur) le mardi 13 et le jeudi 15 octobre de 9 h à 12 h et de 13 h 30 h à 16 h. Il est indispensable de se procurer le polycopié de TP avant le jour J car la séance de TP commence par une interrogation écrite sur les principes et les calculs nécessaires à la manipulation et à sa compréhension. L1 - TRAVAUX PRATIQUES DE BIOCHIMIE STRUCTURALE La composition en acides aminés (type et nombre d acides aminés) des protéines est variable d une protéine à une autre. Il est possible, en réalisant une hydrolyse des liaisons peptidiques par méthode chimique (HCl 6M, 110 C, plusieurs heures), de libérer tous les acides aminés d une protéine. On peut alors déterminer, par différentes méthodes, la composition en acides aminés de cette protéine. Au cours de ce TP vous allez aborder deux techniques qui servent à obtenir des informations sur la composition en acides aminés d une protéine : I- la détermination du nombre d un acide aminé particulier, la tyrosine, grâce à un dosage spécifique, II- la détermination d une composition en acides aminés par chromatographie sur couche mince. Ces deux techniques ne permettent pas, à elles seules, de connaître la composition en acides aminés d une protéine mais donnent des informations partielles qui rajoutées à d autres permettrons de connaître cette composition. 4

5 I- Détermination du nombre de tyrosine de la caséine β à partir du dosage, dans un hydrolysat, de la tyrosine libre La caséine β est une protéine issue du lait. Sa masse moléculaire est d environ 25,0 kda. Un hydrolysat de caséine a été obtenu par hydrolyse acide. Cet hydrolysat contient environ 40 % d acides aminés libres, le reste est constitué de peptides non totalement hydrolysés. A- Principe du dosage de la tyrosine par le réactif de Folin-Ciocalteu Afin d évaluer le nombre de tyrosine contenues dans la caséine β, on réalise un dosage de cet acide aminé à l aide du réactif de Folin-Ciocalteu à partir d une solution d hydrolysat de caséine. En milieu alcalin le réactif de Folin Ciocalteu (complexe phosphomolybdique-phosphotungstique) est réduit par le noyau phénolique des résidus de tyrosine libres. Cette réaction donne une coloration bleue permettant un dosage colorimétrique. Pour quantifier la quantité de tyrosine libre de l hydrolysat à étudier, il faut réaliser une gamme de référence (ou gamme étalon) avec une solution pure, de concentration connue, de tyrosine. B) Réalisation du dosage 1) Solutions et réactifs - HCl 0,2 mol/l (50 ml) - NaOH 0,2 mol/l (50 ml) - Réactif de Folin (dilué au ½) - Hydrolysat de caséine : solution à 4,2 g de protéines/l (dite solution mère) - Solution de référence (tyrosine) à 50 mg/l solubilisé dans HCl 0,2 mol/l (masse molaire de la tyrosine = 181 g/mol) Q : Comment préparer une solution de HCL à 0,2 mol/l à partir d HCL concentré à 36%?sachant que la masse volumique d une solution à 36% = 1.18 kg/l ; masse molaire de HCL = 36,5 g/mole ; qu une solution à 36% signifie 36 ml HCL pur /100 ml de volume final. Pour faire ce calcul il vous faut calculer la concentration massique de HCL dans cette solution (g/l). 2) Préparation de la gamme d étalonnage A partir de la solution de référence, réaliser une gamme de concentration allant de 0 à 50 mg/l dans un volume de 1 ml final. T Tyr (mg/l) Tyr (µl) HCl qsp 1mL Le tube T est un tube témoin : Quel est l intérêt de ce tube? Quel doit être sa composition? Quelles solutions et quels volumes allez-vous pipeter? Vous pipeterez les solutions de tyrosine et d HCl 0,2 mol/l avec un Pipetman (P1000). Il est nécessaire de changer de pointe lorsque vous changer de solution. 3) Préparation des échantillons d hydrolysat Faire une solution diluée de moitié de la solution mère d hydrolysat de caséine, dans un volume final de 1ml, en utilisant la solution d HCL 0,2mol/L. Procéder, pour doser la quantité de tyrosine dans les tubes de la gamme étalon et dans les tubes d hydrolysat (solution mère d hydrolysat (tube 6) et solution diluée de moitié (tube 7)), suivant la procédure décrite ci-dessous «Réaction colorée de dosage de la tyrosine» 5

6 . 4) Réaction colorée de dosage de la tyrosine Les réactions colorées sur les dilutions de la gamme étalon (tubes T et 1 à 5) et sur les échantillons d hydrolysat de caséine (tubes 6 et 7) doivent être faites toutes en même temps. Pour chaque échantillon (8 tubes =T+7) : - Prélever 500 µl de la solution (solution de la gamme étalon ou solution d hydrolysat), - Ajouter 2,5 ml de NaOH 0,2 mol/l, - Ajouter 0,25 ml de réactif de Folin, - Agiter au vortex. Attendre 5 à 10 min avant de lire les absorbances à 750 nm contre le témoin (T) noter les valeurs. Question : Pourquoi utilise-t-on une solution diluée de l hydrolysat de caséine pour réaliser le dosage de la tyrosine libre? C) Analyse des résultats. Calcul de la concentration massique de tyrosine et du nombre de tyrosine A partir des valeurs d absorbance en fonction de la concentration en tyrosine, tracer la courbe de référence. En déduire la concentration massique de tyrosine dans l hydrolysat de caséine. A partir de cette concentration massique calculer le nombre de tyrosine par molécule de protéine (reportez vous pour ce calcul au TD n 1, en faisant attention au fait que dans le cas traiter en TP l hydrolyse de la caséine n est pas totale). II- Séparation, par chromatographie de partage, des acides aminés d un mélange A- Introduction 1- Principe de la chromatographie de partage Lorsqu'une substance est mise en présence de 2 solvants non miscibles elle se répartit entre ces 2 solvants selon son coefficient de solubilité pour chacun des solvants. Ce coefficient est caractéristique de la substance étudiée, indépendant de sa concentration et n'est pas affecté par la présence d'autres solutés. Ce principe sera utilisé pour la séparation d un mélange d acides aminés par chromatographie sur couche mince. Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire correspond au support polaire, constitué de cellulose fixée sur un film plastique. La phase mobile est constituée d un solvant apolaire qui migre le long de la phase stationnaire par capillarité. Plus les substances du mélange sont solubles dans la phase mobile plus elles migreront sur le support et plus les substances sont solubles dans la phase stationnaire moins elles migreront. La solubilité des acides aminés dans la phase polaire (fixe) ou apolaire (mobile) va dépendre de la structure chimique de leur chaîne latérale, la présence d atome O ou N étant déterminante pour le caractère hydrophile (solubilité dans un solvant polaire) ou hydrophobe (solubilité dans un solvant apolaire). 2- Matériel utilisé Cette chromatographie est réalisée dans une cuve de verre (dite «cuve sandwich»), close, dont l'atmosphère est saturée par la phase mobile. Le mélange à analyser est déposé à l'une des extrémités de la 6

7 feuille (voir figure 1). Cette extrémité est mise en contact avec la phase mobile. Le mélange monte par capillarité, la chromatographie est de type ascendante. cuve sandwich plaque de cellulose solvant Figure 1 dépôt acides aminés 3- Analyse des résultats Afin de pouvoir comparer les migrations on définit le : Rf = Distance parcourue par le composé Distance parcourue par le solvant qui permet à tout moment d exprimer la migration relative de l acide aminé par rapport à une référence, ici le front du solvant. Ce Rf est caractéristique d'une substance dans des conditions expérimentales données. Les acides aminés hydrophiles resteront près du dépôt. Les acides aminés hydrophobes seront entraînés dans la phase mobile et migreront loin du dépôt. Dans ces conditions le Rf des acides aminés hydrophiles aura une valeur bien plus faible que le Rf des acides aminés hydrophobes. Pour identifier un acide aminé inconnu il est nécessaire d analyser, en parallèle sur la même plaque, des acides aminés connus qui serviront de comparaison. Le Rf des acides aminés connus et inconnus sera alors comparé. B- Application Cette technique va être utilisée pour connaître la composition en acides aminés de tri peptides hydrolysés. 1) Support utilisé Le support utilisé est un «film» dont la partie active (100 µm d'épaisseur sur le support en polyester) est constituée par une couche de cellulose fabriquée à l'aide de cellulose spéciale et d'un liant. Celui-ci, nécessaire pour assurer une souplesse, une adhérence et une cohésion convenable du film, a été choisi de manière à ne pas influer sur les propriétés adsorbantes de la cellulose. Le pouvoir de résolution très élevé de ces films permet d'obtenir de très bons résultats avec des migrations de 8 à 10 cm seulement. 2) Application des échantillons Chaque dépôt de solutions (hydrolysat de tripeptide ou solutions d acide aminé connu) est effectué avec des capillaires de sorte que le volume déposé en une fois soit de l'ordre de 0,2 µl à 0,5 µl afin de donner des dépôts de petite dimension ayant 1 à 3 mm de diamètre. Tracer la ligne de dépôt à 2 cm du bord inférieur du film (très légèrement avec un crayon HB ou 4B). A partir d un bord, tracer sur cette ligne un repère tous les 1 cm (9 repères). Déposer chaque acide aminé connu (8) et 2 fois le mélange d'acides aminés à analyser, sur la ligne de dépôt, au milieu de l'intervalle entre les repères. Ces dépôts sont séchés à l air libre avant de faire la chromatographie. 7

8 ATTENTION : ne pas mettre les doigts sur la surface mate de la plaque de cellulose qui est la face active. 3) Réalisation de la chromatographie Tout le dispositif est installé sous une hotte aspirante à cause du butanol. Le film est placé entre deux plaques de verre ; après avoir fixé les pinces de serrage, l'ensemble est placé dans un bac contenant 120 ml du mélange de solvants (butanol normal 80 ml, acide acétique concentré 20 ml, eau distillée 20 ml). L'évaporation est très réduite dans le type de cuve utilisée et il n'est pas nécessaire de prendre des précautions spéciales pour assurer la saturation. Quand la phase mobile atteint les 3/4 du film, le chromatogramme est retiré de la cuve. Le front du solvant est souligné délicatement au crayon à papier. Le film est ensuite séché à l air libre sous la hotte. 4) Révélation du chromatogramme Elle est obtenue en pulvérisant sur le film (sous la hotte, voir les enseignants), une solution de ninhydrine à 0,2% dans le mélange éthanol-acide acétique (4V : 1V) et en séchant ensuite le chromatogramme pendant 2 à 3 minutes dans une étuve à 80 C. Exemple de préparation de la solution de ninhydrine à 0.2%. Pour préparer 200 ml de cette solution : - on pèse 0,4g de ninhydrine (poudre) sachant qu une solution à X% signifie Xg dans un volume de 100 ml (assimilé à 100 g final). - on prépare le mélange éthanol, acide acétique dans une proportion 4 volumes d éthanol pour 1 volume d acide acétique (noté classiquement 4:1). La somme des 4+1 volumes doit être égale 200 ml dans notre cas. On fait donc le mélange suivant : 160 ml d'éthanol + 40 ml d'acide acétique - on dissout les 0,4 g de ninhydrine dans un volume inférieur à 200 ml du mélange éthanol-acide acétique. Après dissolution de la ninydrine on ajuste le volume à 200 ml avec le reste du mélange. 5- Résultats Faire un tableau des valeurs de Rf obtenues pour les acides aminés de référence et ceux du mélange. En déduire la composition du mélange. 8