Partie 2. 4 et

Transcription

1 Partie 2 4 et

2 Revenons un peu en arrière. Sur la capacité inductrice de la lèvre dorsale du blastopore Une expérience ancienne, mais déterminante!

3 Expérience de Spemann et Mangold (1924)

4 Conclusion: Analyse histologique L analyse histologique met en évidence deux axes embryonnaires complet. La distribution du pigment révèle les contributions respectives de l implant et des tissus de l hôte: - chorde - région proximale des somites - toit de l archentéron de l embryon secondaire La lèvre dorsale est un tissu inducteur = centre de Spemann

5 Conclusion Les cellules de l embryon en segmentation sont déterminées. (cellules inductrices) Molécules inductrices sécrétées (cellules cibles) Récepteurs spécifiques Signalisation > protéines cytoplasmiques Réponse cellulaire

6 Les cultures de blastomères isolés mettent en évidence un processus d induction V D Les blastomères dorso-végétatifs forment un centre inducteur = centre de Nieuwkoop expériences de Nieuwkoop (1980)

7 Les cellules de la zone marginale dorsale (ZMD) répondent à des facteurs diffusibles et constituent le centre de Spemann >>> dorsalisation V D centre de Spemann Voir expérience de Spemann et Mangold (1924)

8 5) Recherche de molécules participant à l induction du mésoderme

9 5.1. Identifier et quantifier les molécules responsables Techniques Détection: ARN: hybridation «in situ» (sondes spécifiques) Protéines: immunolocalisation (anticorps spécifiques) Quantification ARN: Northern blot Protéines: Western blot

10 Vésicule germinative Exemple: hybridation «in situ» avec une sonde «Vg1» (ovocyte au stade prophase I)

11 Quantifier les ARN par Northern Blot On prélève le tissu d intérêt et on extrait les ARN totaux On fait migrer les ARN sur un gel d electrophorèse On transfert les ARN sur une membrane de nitrocellulose On dépose sur la membrane une sonde radioactive (spécifique de l ARN d intérêt) On révèle par autoradiographie

12 Quantifier les protéines par Western Blot - Extraction des protéines -Migration - Transfert - Révélation par un anticorps couplé à une molécule qui colore un substrat

13 Tests in vitro Dissection du toit d un embryon au stade blastula Incubation des cellules avec une molécule à tester Analyse histologique - Nature des structures induites? - Recherche des marqueurs dorsaux ou ventraux?

14 Tests in vivo (1) 1) Irradiation du pôle végétatif par des rayons U.V. Résultat: absence de structures dorsales 2) Injection de l ARNm d un inducteur potentiel: Question: restauration de structures dorsales?

15 Tests in vivo (2) Injection dans un blastomère végétatif de la région ventrale d un ARNm codant pour une protéine à tester Question: production d un axe surnuméraire?

16 5.2. Identification de facteurs inducteurs du mésoderme: des facteurs de croissance Parmi l ensemble des facteurs de croissance, 2 familles identifiées : -FGF (Fibroblast Growth Factor) -TGFβ (Transforming Growth Factor) Peptides de masse moléculaire de 15 à 35 kda Remarque: chez l adulte, les facteurs de croissance influencent la prolifération et la différenciation cellulaires.

17 FGF = Fibroblast Growth Factor Fixation du FGF Dimérisation du récepteur Phosphorylation des tyrosines cytoplasmiques Deux voies de signalisation activées une voie requise: MPAK

18 Chez l amphibien, au moins 4 FGF identifiés, localisés dans les blastomères végétatifs Expérience: + FGF V D Voie MAPK On note une modification d expression de gènes cibles (exemple: Xbra = Xenopus brachyury) Résultat: induction de mésoderme Conclusion: les FGF sont des candidats

19 TGFβ, famille d une trentaine de molécules: Sous-famille des activines, Vg1, Nodal, et BMP Récepteur hétérodimérique Sérine, thréonine kinase Phosphorylation des smad, médiateurs intracellulaires de signalisation Translocation et modulation de la transcription

20 Les TGFβ inducteurs de mésoderme? Activine A culture de cellules endodermiques Smith, (1987) + activine A Induction de structures mésodermiques (cellules musculaires, corde) Mais.. 1) Expression du messager après la transition blastuléenne 2) Effet dépendant de la dose Conclusion: il existe d autres facteurs plus précoces

21 Vg1 Autre approche: biologie moléculaire recherche d ARNm exprimés uniquement dans les blastomères végétatifs Melton, Vg1 présent dans l ovocyte I (forme inactive dans l hémisphère végétatif) (voir marquage in situ plus haut) - Activation de Vg1 suite à la réaction corticale et l activation d une protéase

22 Des ARNm et des protéines sont concentrés au niveau du cortex de l hémisphère végétatif Vg1

23 Vg1 Au cours de la segmentation, répartition différentielle des constituants dans les blastomères > Vg1 (ARNm) est enrichi dans les blastomères végétatifs dorsaux

24 Expériences: 1) calotte animale + Vg1 mésoderme dorsal 2) Restauration d un axe embryonnaire (structures dorsales) surnuméraire si l ARNm est injecté dans un blastomère végétatif ventral au stage morula Conclusion: Vg1 est un composant du centre inducteur de Nieuwkoop.

25 Nodal Gradient spatio-temporel d expression chez la blastula: cellules végétatives dorsales > ventrales Expérience indirecte + injection d un fragment de la protéine: effet inhibiteur de la fixation de nodal sur son récepteur Résultat: absence de cellules de chorde, musculaires et sanguines

26 Wnt Wnt = contraction de Wingless (wg) et de int- (integration site) Protéines de signalisation Récepteurs: frizzled (Fzd) et LRP Mais..16 membres chez le xénope!! Conclusion Plusieurs facteurs de croissance sont impliqués dans la formation du mésoderme: FGF, Vg1, Nodal Question: dans les sous-familles Wnt et BMP (famille TGFβ), quel facteur est plus précisément impliqué?

27 5.3. Les facteurs de croissance impliqués provoquent un changement d expression du génome grâce à des facteurs de transcription spécifiques Recherche de facteurs de transcription spécifiques et de protéines régulatrices cytoplasmiques et/ou sécrétées Parmi ces protéines de signalisation Dsh (Dishevelled), protéine cytoplasmique GSK3, Glycogen-synthase kinase-3 β-caténine, facteur de transcription et protéine de jonction!

28 Revenons à l ovocyte fécondé Distribution des ARNm et des protéines stockés ARNm Vg1 Protéine Dsh, dishevelled

29 La protéine Dsh (Dishevelled) est ancrée aux microtubules, concentrée dans la région du pôle végétatif

30 La distribution de Dsh n est plus uniforme: enrichissement dans la future région dorsale

31 Dsh est une protéine cytoplasmique intermédiaire dans la voie de signalisation Wnt

32 Conclusion: En absence de Wnt, GSK3 est active, et une fraction importante de la β-caténine est dégradée En présence de Wnt, GSK3 est inhibée, la β-caténine est libérée du complexe, et peut agir comme facteur de transcription Conséquence

33 Si cette hypothèse est correcte, on doit retrouver des protéines impliquées dans le signal comme la β-caténine

34 Localisation de la β-caténine en début de gastrulation, par une technique d immunofluorescence. Blastocèle La ß-caténine est prépondérante dans la future région dorsale

35 La β-caténine elle-même répond-elle aux critères d inducteur de dorsalisation? Expérience: Injection de β- caténine dans la région ventrale

36 Résultat: obtention d un embryon double, comme lors de la greffe ventrale de la lèvre dorsale du blastopore dans l expérience de Spemann et Mangold!

37 Dans la famille Wnt, quel est celui (ou ceux) qui provoque(nt) la synthèse de β-caténine? Expérience: les cellules sont incubées en présence de différents facteurs Wnt et on mesure l expression de ß- caténine (ARNm, technique du Northern blot) ß-caténine Conclusion: Xwnt-8 est un bon candidat pour induire la synthèse de ß-caténine

38 Expérience in vivo (sur embryon entier) Les embryons sont incubés avec ou sans Xwnt-8 et on observe ensuite où est localisée la β-caténine (immunohistochimie) Contrôle + Xwnt-8 Résultat: l expression semble plus importante et la localisation devient également nucléaire

39 Conclusion: Xwnt-8 Stimule la synthèse et la localisation nucléaire de ß-caténine Dorsalisation Mais combien d étapes entre ß-caténine et dorsalisation?

40 Au niveau de la blastula Micromères (zone marginale dorsale > mésoderme) ß-caténine Signaux de dorsalisation Récepteur Fzd/LRP Macromères (endoderme) Xwnt-8 Xwnt-8

41 Centre de Spemann Centre de Nieuwkoop Quelques «acteurs»: Vg1 Nodal (concentration élevée) β-caténine Suite: - Comment la ß-caténine agit pour «dorsaliser»? - Quelle(s) cible(s) dans l organisateur de Spemann?

42 Toujours la même stratégie, chercher un gène qui ne s exprime que dans l organisateur de Spemann Un candidat? «Siamois» B: ARNm de Xwnt8 Expérience: B, C, D: la transcription de Siamois est bloquée, et on a injecté dans l embryon: Malgré Xwnt-8 ou β-caténine, pas de dorsalisation: C: ARNm de ß-caténine D: ARNm de Siamois Siamois est donc capital et est en aval de Xwnt-8 et de β-caténine E: Embryon témoin

43 L expression du gène siamois est sous la dépendance du facteur de transcription β-caténine

44 Conséquence Xwnt-8 Localisation nucléaire de ß-caténine Siamois Dorsalisation

45 Quel est le rôle de Siamois? Expérience: effet de siamois sur l expression de gènes cibles? Northern blot (ARNm) Piste 3: Effet de Siamois Nog = Noggin Chd = Chordin Noggin et chordin sont des protéines sécrétées Conclusion: la synthèse de Noggin et de Chordin est stimulée sous l effet de Siamois

46 Localisation et rôle de Noggin, Chordin? Chordin, Noggin et Siamois sont localisés dans la future région dorsale (mesure des ARNm par Northern Blot)

47 Autre approche: transplantation d une région marquée (embryon bleu) et suivi des cellules descendantes (bleues) En parallèle, suivi de l expression de chordin Cellules Marquées ARNm Chordin Lors de la gastrulation, les cellules qui expriment chordin se trouvent dans la future région dorsale

48 Complétons le schéma Micromères (zone marginale dorsale > mésoderme) Chordin, Noggin Siamois ß-caténine Signaux de dorsalisation Récepteur Fzd/LRP Macromères (endoderme) Xwnt-8 Xwnt-8

49 Noggin et chordin sont des protéines sécrétées Elles induisent un axe secondaire et des structures dorsales Elles répondent par conséquent aux critères expérimentaux Comment Chordin contribue à la dorsalisation?

50 En empêchant BMP4 d agir (Bone Morphogenetic Protein 4) (Famille TGFβ) BMP4: induit du mésoderme ventral et latéral, protéine sécrétée. Les ARNm sont présents dans les cellules de la blastula Expérience: injection de l ARNm dans un blastomère dorsal (stade 4) > embryon ventralisé Conclusion: effet antagoniste par rapport aux facteurs de transcription dorsalisants

51 Chordin et Noggin inhibent la fixation de BMP4 sur son récepteur Famille des TGFβ Signalisation: Voir précédemment Chordin Noggin Phosphorylation de Smad1 et de Smad5 qui agit avec Smad4. Complexe de transcription qui notamment inhibe les gènes de différenciation nerveuse (neurectoderme)

52 ET DONC! ventralisation Chordin, Noggin sécrétées Micromères BMP4 Chordin, Noggin Siamois dorsalisation ß-caténine Récepteur Fzd/LRP Macromères (endoderme) Xwnt-8 Xwnt-8

53 Action antagoniste de Xwnt et BMP4

54 Bien sûr, d autres molécules interviennent dans ce processus complexe!! Exemple de quelques gènes exprimés dans le centre ventral et l organisateur de Spemann