GMO Screening/Endogene Detection Assay Real-Time PCR detection kit PGE01A/PGE01A-50, PGE02A/PGE02A-50, PGE03A/PGE03A-50,

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1 MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay Real-Time PCR detection kit Cat.# PGE01A/PGE01A-50, PGE02A/PGE02A-50, PGE03A/PGE03A-50, PGE04A/PGE04A-50, PGE06A/PGE06A-50, PGE07A/PGE07A-50, PGE08A/PGE08A-50, PGE09A/PGE09A-50, PGE10A/PGE10A-50, PGE11A/PGE11A-50, PGE12A/PGE12A-50, PGE13A/PGE13A-50, PGE14A/PGE14A-50, PGE15A/PGE15A-50, PGE16A/PGE16A-50, PGE17A/PGE17A-50, PGE19A/PGE19A-50, PGE20A/PGE20A-50, PGE21A/PGE21A-50, PGE22A/PGE22A-50, PGE23A/PGE23A-50, PGE24A/PGE24A-50, PGE25A/PGE25A-50, PGE27A/PGE27A-50, PGE28A/PGE28A-50, PGE29A/PGE29A-50, PGE30A, PGE31A Mode d emploi Via San Geminiano, San Prospero (MO)- Italy : : : laboratorio@generon.it : [1] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

2 1 - Introduction L introduction des récoltes OGM dans la chaine alimentaire a mené au besoin de rechercher leur présence dans une large série de matières premières, produits semi-finis ou finis ainsi que dans les nourritures pour animaux. La Commission Européenne a d avance introduit des seuils pour la présence accidentelle inévitable des ingrédients GM ; conformément à EU Reg. CE/1829/2003, tous les produits (aliments pour hommes et animaux, dérivés OGM, cultures, aromes et additifs) sont étiquetés pour leur contenu OGM. La PCR en temps réel est la méthode à la pointe pour la détection des OGM, et son usage est réglé par des spécifiques normes ISO (à savoir ISO ). La présence des OGM peut être recherchée à travers la détection de séquences d ADN des éléments de contrôle génétique comme les promoteurs, les terminateurs de la transcription, et les marqueurs, comme les gènes de résistance. Performances du test Le Test de Détection MODIfinder GMO SCREENING\ENDOGENE détecte la cible du screening OGM ou la cible du TAXA ENDOGENE seulement si tous les composants recommandés sont conservés correctement et si les protocoles recommandés sont suivis. Quand utilisés en association avec Generon ION Force DNA Extractor FAST (Cat. # EXD001) les tests ont une Limite de Détection (LOD) de 0.01%. La limite de détection dépend strictement de la matrice et de la taille génomique du taxa en étude, il y a donc un LOD théorique en dessous duquel on ne peut pas descendre. [2] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

3 2 Test de SCREENING\ENDO QUALITATIF MODIfinder Ce test de PCR en temps réel détecte une séquence d ADN spécifique dans l ADN du cible en moins de 1.5 heures. L amplification de la séquence cible est mesurée à travers l utilisation d une sonde spécifique marquée par fluorescence (FAM). 2.1 Contenu du kit Boite 50 réactions Boite 100 réactions N. tubes Volume (μl) N. tubes Volume (μl) GENERase Mastermix MODIfinder OLIGO Mix * (OLIGOS and Probe pre-blended mix) Témoin Positif Témoin Négatif * Les réactifs sont fournis avec un 5% de volume en plus. 2.2 Informations de Stockage & Expiration Date d expiration: voir la date sur la confection, la validité du produit est référée au produit maintenu intact dans son emballage original. Protéger les réactifs de l exposition à la lumière car les réactifs OLIGO Mix sont photosensibles. Conserver congelés. [3] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

4 3 Matériaux et équipement nécessaires 3.1 Extraction (1) Matériel/Equipement Kit d Extraction Produits chimiques: n-esane Source Generon ION FORCE DNA Extractor FAST (Cat. # EXD001) Fournisseurs Tubes, 15 et 50 ml Adaptateurs pour colonnes et seringues (EXD010-A) Cuillères en plastique Balance technique ou similaire, précision : 0.01 g Seringues 10 ml, sans aiguille, et filtres en cellulose acétate, taille des pores 0.45 μm Cylindre gradué, 50 ml Moulin pour homogénéiser ou équivalent Centrifugeuse avec rotors pour microtubes de ml et pour tubes de 50 ml (range entre rpm) Bain thermostatique à eau ou Thermobloc chauffé jusqu à to 85 C ± 2 C Set de pipettes Set d embouts (Barrier) Rack pour tubes de 1.5 ml Microtubes de 2.0 et 1.5 ml Chambre à vide pour extraction de l ADN et pompe à vide ou Venturimètre Chaque étape de préparation de l échantillon (broyer, transférer, peser, etc.) doit être faite conformément aux GLP (Good Laboratory Practice) afin de minimiser les chances de contamination croisée entre les échantillons. Il est recommandé d utiliser l équipement jetable quand possible. Si les échantillons alimentaires ne sont pas sous forme de poudre ou de granules, ils doivent être traités (broyés ou mélangés) avant l extraction de l ADN. La plupart des méthodes d extraction de l ADN supportent de 20 à 50 mg de matériel de début. Generon ION Force DNA Extractor FAST (Cat. N. EXD001) permet le traitement jusqu à 20 grammes du matériel de début, afin de maximiser la représentation du lot de l échantillon. Une fois que l échantillon a été pulvérisé/homogénéisé, il peut être pesé et extrait dans la quantité appropriée en accord avec la méthode d extraction de l ADN. Faire référence au mode d emploi du fabriquant pour les détails de la procédure d extraction. 3.2 Détection par PCR en temps réel [4] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

5 Matériel/Equipement Source Système de Real-Time PCR (2) MODIfinder GMO Screening Endogene Detection Assay Generon Cat. # PGEnnA Film Optique Adhésif ou Bouchons Optiques Plaque optique de réaction ou Strips de Tubes Optiques Set de micropipettes (1) Equipement nécessaire seulement quand ION Force DNA Extractor FAST (Cat. # EXD001) est utilisé. (2) Le kit a été validé sur Bio-Rad CFX Deep-Well. Le kit est compatible avec d autres instruments de Real-time PCR exclus Roche Light Cyclers I et II. [5] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

6 4 Détection par PCR en temps réel 4.1 Préparation de la réaction I. Faire décongeler les réactifs (GENERase Mastermix, MODIfinder OLIGO MIX, Témoin Positif et Témoin Négatif). Une fois décongelés, agiter les tubes avec le vortex et spinner pour faire déposer le contenu au fond du tube. II. III. IV. Mélanger 150 µl de MODIfinder OLIGO Mix avec 750 µl de GENERase Mastermix pour préparer la MODIfinder Working Mastermix (WMX-GM). Vortexer rapidement et spinner pour homogénéiser le mélange. Transférer 18 µl de WMX dans chaque puits. V. Ajouter 12 µl de Témoin Négatif dans les puits de contrôle négatif. VI. VII. VIII. IX. Ajouter 12 µl de chaque échantillon dans les puits dédiés au test des échantillons inconnus. Ajouter 12 µl de Témoin Positif dans les puits de contrôle positif. Fermer les puits et vérifier l absence de boules dans le fond des puits. Spinner rapidement les tubes optiques de PCR ou les plaques. 4.2 Préparation de l instrument Avec GENERase Mastermix régler les paramètres suivants dans le thermocycleur : I. Volume Total de Réaction: 30 µl II. III. Fluorophores/Quenchers: cible GMO SCREENING ou ENDOGENE (FAM/BHQ1-NFQ); Profil thermique: Étape T ( C) Durée Loops UNG 50 2 min 1 Activation de la Taq min 1 Dénaturation de l ADN sec Appariement/Elongation + Lecture de la Plaque sec 45 [6] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

7 5 Interprétation des Données L évaluation des résultats doit être faite conformément au logiciel d analyse recommandé par le fabriquant de l instrument de Real-Time PCR. Une fois réalisé la PCR, chaque échantillon est analysé avec le logiciel de l instrument pour produire une valeur Cq (cycle de quantification) de chaque colorant. Ces valeurs sont utilisées pour déterminer la présence (Test Qualitatif) des cibles OGM SCREENING ou ENDOGENE dans l échantillon. Voir ci-dessous un exemple des graphiques obtenus pour un contrôle positif (Fig.A) pour l amplification des cibles SCREENING OGM ou ENDOGENE (ligne bleu). FAM Après avoir fixé le seuil, le résultat de l analyse pour les échantillons inconnus doit être évalué en suivant les indications ci-dessous. Si on rencontre les conditions ci-dessous; TEST Screening OGM ou ENDOGÈNE (FAM) Témoin Positif + Témoin Négatif - Alors les possibles résultats pour chaque échantillon sont: TEST GMO screening or ENDOGENE (FAM) Echantillon positif + Echantillon négatif - Echantillon invalide (Inhibé) - En cas d inhibition, il faut améliorer l isolation et la purification de l AND pour les échantillons ou il faut diluer l échantillon avant l exécution d un nouvel test, Voir le paragraphe Résolution des Problèmes (section 6) pour avoir plus de suggestions. [7] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016

8 6 Résolution des Problèmes I. Absence d amplification concomitante de la cible et de l endogène, ou courbes d amplification anormales. Causes possibles et actions de correction: Un excès d AND dans la cible a inhibé la réaction et l endogène peut avoir été affecté à cause d un excès d AND et/ou d inhibiteurs de la PCR. Echantillons de test dilués 1:10 et 1:100. Utilisez s il vous plait l Eau DNase/RNase Free Water pour préparer les dilutions. Une fermeture inadéquate des bouchons/films optiques a causé l évaporation de l échantillon. Refaire l analyse en utilisant les instruments appropriés et les bouchons/films optiques appropriés pour assurer un fixage parfait. Vous n avez pas utilisé les consommables adéquats. Refaire l analyse et utiliser seulement des plaques optiques à 96 puits avec des films optiques adhésifs ou des strips de 8 tubes optiques avec des bouchons. Les échantillons n ont pas été préparés correctement. Refaire la préparation des échantillons d ADN. S assurer que la méthode d extraction de l ADN soit exécutée correctement. II. Les réactions du Témoin Positif n ont pas amplifié, mais les autres réactions résultent correctes (par exemple l endogène est amplifié): L ADN du Témoin Positif n a pas été ajouté aux puits de réaction. Si les autres réactions résultent normales, il n est pas nécessaire de répéter la course. III. Les réactions du Témoin négatif sont positives: Contamination du tube du Témoin Négatif ou du mix MODIfinder PCR avec MODIfinderpositive DNA. Faire plus d attention afin de prévenir la contamination pendant la manipulation des réactifs du test et pendant la mise en place du test. Si vous avez besoin de support contactez Generon à: laboratorio@generon.it 7 Limitation de Responsabilité Generon S.p.A. garantit à l acheteur seulement la qualité des réactifs et des composants utilisés pour fabriquer le produit. Generon S.p.A. n est pas responsable, et ne peut pas être retenu responsable ou conjointement responsable, pour tout possible dommage résultant de l utilisation du produit par l utilisateur et des données obtenus. [8] Mode d emploi - MODIfinder GMO Screening/Endogene Detection Assay - Rev. 1-29/07/2016