DIU de Pathologie Moléculaire. Etude de la clonalité lymphocytaire : principes et applications

Transcription

1 DIU de Pathologie Moléculaire Module 3, Pathologie moléculaire appliquée Bordeaux, 2013 Etude de la clonalité lymphocytaire : principes et applications Service de Biologie des Tumeurs. - CHU Bordeaux EA 2406 Histologie et Pathologie Moléculaire des tumeurs - Université Bordeaux 2 Pierre.Dubus@histo.u-bordeaux2.fr

2 Principes généraux de la tumorigenèse Evénements moléculaires

3 Principes généraux des études de clonalité lymphocytaire Cellule lymphoïde = réarrangements des gènes des récepteurs à l antigène Si Cellule lymphoïde B = réarrangements des gènes des chaînes des immunoglobulines Si Cellule lymphoïde T = réarrangements des gènes des chaînes des récepteurs T cellulaires (ou TCR) Marqueur moléculaire spécifique - de la cellule

4 - de son éventuelle descendance

5 Intérêts Aide au diagnostic des infiltrats lymphoïdes (cas difficiles). Bilan d extension des lymphomes et suivi moléculaire (traceur de la maladie) Facteur pronostique (lymphomes cutanés)

6 Intérêts Aide au diagnostic des infiltrats lymphoïdes Question : pseudo-lymphome versus lymphome? Polyclonal ( hétérogène ) Monoclonal (lymphome?)

7 Lymphomes Parfois anomalie génétique récurrente identifiée Cible de l analyse moléculaire Marqueur moléculaire universel Monoclonalité Ig/TCR

8 Clonalité = analyse globale de l ADN Difficultés pseudo-lymphome versus lymphome? Polyclonal Avec stimulation antigénique «rai-faux positif» Monoclonal Avec fond polyclonal «faux négatifs» Matériel très peu abondant Faux positif (amplification) et faux négatif

9 Etudes de clonalité lymphocytaire Les cibles Les méthodes Protéines (récepteurs à l antigène) ARNm IHC : monotypie k ou l Sans intérêt ADN (gènes des récepteurs à l antigène) Southern blot PCR Principes

10 Exemple : Réarrangement gènes des immunoglobulines : gène IgH (14q32) Configuration germinale = non fonctionnelle Exons (300) Exons D (30) Exons (6) Exons C (11) m d Réarrangement : Différentiation B lymphocytaire m d N D N PCR Transcrits D-C

11 Technique de base : étude des réarrangements B lymphocytaires 1) Extraction ADN Tissus congelés Tissus fixés par le formol ADN +/- cassés 2) PCR avec amorces consensus et 3) Migration sur gel (ou analyseur de fragment) Séparation en fonction de la taille des amplicons 4) Interprétation

12 Prolifération lymphocytaire B Polyclonale Clonale D D D D D D D D D D

13 Analyse IGH FR3-H, protocole maison (Dubus et al, Ann Pathol 1994; 4: ) 1 primer FR3 + 2 primers H 2 PCR complémentaires Reproductible Absence de bande pseudoclonale Applicable FFPE, bp Robuste Peu couteuse Quelques Faux négatifs compléter par BIOMED-2 (si applicable)

14

15 Interprétation clonalité B! Faux négatifs Positivité dans 50 % à 80% des lymphomes B Pas d intérêt diagnostique si le lymphome est évident Si difficulté diagnostique lymphome / pseudolymphome intérêt de la clonalité + seule mais clonalité malignité Protocole Biomed 2, positivité > à 90% des lymphomes B Ganglionnaires (si ADN de qualité!)

16 PCR B Biomed 2 an Dongen, M et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT Leukemia. 2003, 17(12): Kits standardisés

17 PCR IgH Biomed 2

18 BIOMED-2 strategy IGH x % Monoclonalité MCL 100 CLL 100 FL ALL 50 (SHM) D incomplets (tubes D et E) FFPE samples FR1-H? Pseudoclonalité Reproducibilité X plicates?

19 PCR IgK Biomed 2 Kde = Kappa deleting element Les réarrangements κ-kde et κ-cκ intron-kde obtenus sont le résultat de réarrangements infructueux conservés par la cellule B

20 PCR B Biomed 2 : profils polyclonaux IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

21 PCR B Biomed 2 : Profil clonal majoritaire IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

22 PCR B Biomed 2 : Profil clonal majoritaire IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

23 PCR B Biomed 2 : Profil clonal majoritaire IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

24 PCR B Biomed 2 : Profil clonal majoritaire IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

25 PCR B Biomed 2 : Echec / ADN de mauvaise qualité IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

26 PCR B Biomed 2 : Profil clonal minoritaire IgH FR1-H IgH FR2-H IgH FR3-H Igk - κ-kde + κ-cκ

27 Structure et localisation des gènes des TCR

28 Lymphocytes T : Gènes TCR d Non réarrangés : configuration germinale Réarrangement (D) Spécifique d un lymphocyte T

29 Technique : PCR Multiplex / DGGE 1) Extraction ADN Tissus congelés Tissus fixés par le formol 2) PCR 4 amorces avec clamps GC 4 amorces Theodorou et al Blood 1995

30 Polyclonale Prolifération T Clonale

31 3) Analyse sur gel DGGE Polyclonal Non réarrangé Clonal Clonal minoritaire Sensibilité : 1-5%

32 Interprétation clonalité T! rai-faux positifs Positivité dans > 95% des lymphomes T mais répertoire TCR limité + en cas de stimulation immunitaire A toujours interpréter en fonction du contexte anatomoclinique Intérêt limité dans la problématique lymphome / pseudolymphome Intérêt des études multi-sites sur lésions diffuses ou multifocales

33 PCR T Biomed 2 an Dongen, M et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT Leukemia. 2003, 17(12): Kits standardisés

34 PCR T Biomed 2 TCR gamma

35 PCR T Biomed 2 - TCR :Comparaison de profils ADN 1 Mix A Mix B ADN 2 Mix A Mix B

36 BIOMED 2 TCR Mix A MixB DGGE TCR 100 pb 200 pb 100 pb 200 pb pb 167 pb 177 pb G699C pb 154 pb 188 pb IS pb 114 pb IS0021 IS pb 168 pb Réarrangements Mono or bialleliques Hétéroduplex : 3 ou 4 bandes (DGGE) Ex. : G699C pb 159 pb 240 pb pb 201 pb

37 PCR T Biomed 2 TCR Beta Intérêt limité : rare lymphomes non clonaux pour TCR

38 PCR T Biomed 2 - TCR Beta contrôle polyclonal Mix A Mix B Mix C

39 PCR T Biomed 2 - TCR Beta contrôle clonaux Mix A Mix B Mix C

40 PCR T Biomed 2 : TCR Delta

41 PCR T Biomed 2 TCR Delta Détection : Gel d acrylamide Hétéroduplex Ou Electrophorèse capillaire

42 !! Monoclonalité Malignité Pathologies monoclonales «bénignes» Pseudolymphomes médicamenteux Recherche d'une cause médicament, allergène (tests) Intérêt surveillance et répétition analyses histologique et moléculaire

43 Intérêts Aide au diagnostic des infiltrats lymphoïdes cutanés Bilan d extension des lymphomes & Facteur pronostique et suivi moléculaire

44 Bilan d extension des lymphomes cutanés & Facteur pronostique et suivi moléculaire Lymphome établi clone de référence «empreinte» moléculaire reproductible objective pour analyses comparatives - autres sites cutanés - ganglion - lymphocytes sanguins - BOM

45 aleur pronostique démontrée dans le cadre des mycosis fongoïdes clone cutané / clone sanguin Analyse du TCR 3 groupes 1) Profil polyclonal sur la peau 2) Clone T cutané, non retrouvé identique dans le sang 3) Clone T cutané, identique peau et sang Sk B Sk B Sk B Sk B Sk B

46 Probabilité de progression selon Le stade Les résultats de la PCR IIb-I Clone peau/sang id p = p = 0.02 Clone cutané Ia-IIa mois Peau polyclonale mois.i.d. 2001, 117;920-6