ANALYSE DES PROTEINES: IMMUNOHISTOCHIMIE, PROTEOMIQUE, MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES

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1 ANALYSE DES PROTEINES: IMMUNOHISTOCHIMIE, PROTEOMIQUE, MODIFICATIONS POST-TRADUCTIONNELLES

2 Quel avenir pour les techniques de détection «in situ» face au développement des techniques «haut débit» d analyse d ADN, d ARN, microarns, etc et des protéines (protéomique)?

3 Techniques Immuno-histologiques Définition & principes Techniques immuno-enzymatiques et Immunofluorescence Limites, pièges: fixation, dénaturation antigènique, contrôles Interprétation Applications : routine et recherche Modifications post-traductionnelles: quelques exemples (protéines phosphorylées, protéines mutées, ) Principes et applications des «puces tissulaires» But : analyse in situ de l expression du produit d un gène

4 IMMUNOHISTOCHIMIE In situ

5 méthode directe Anticorps marqué Antigène à détecter

6 Méthodes directes # indirectes méthode indirecte Anticorps primaire non marqué Anticorps secondaire marqué Antigène à détecter

7 Techniques immunoenzymatiques indirectes PER Anti-lapin PER Ac Lapin anti-souris Ac souris PER Antigène 2 étapes 3 étapes

8 Techniques indirectes avec complexes enzymatiques PAL PAL PER PER APAAP PAP

9 Techniques Avidine(streptavidine)-biotine Peroxidase Complexe Avidine-biotine- Peroxidase Anticorps biotinylé Antigène à détecter

10 Choix de la Technique # marqueurs Fluorochrome (Immunofluorescence) - fluoresceine, Rhodamine,.. ENZYMES (Techniques immunoenzymatiques) - Peroxydase (DAB=brun, AEC=orangé) - Phosphatase Alcaline - Fast Red: rouge

11 Principe de l examen en fluorescence

12 Photon émis l2 > l1 Photon incident l1

13 Techniques immuno-enzymatiques Phosphatase Alcaline Peroxydase

14 Mode d action de la peroxydase Peroxidase H 2 O 2 H 2 O + 1/2 O 2 Diaminobenzidine (DAB) DAB oxydé (marron, insoluble

15 Principe de la technique d amplification à la tyramine PER + H 2 O 2 PER + DAB + H 2 O 2 biotine Fitc Fitc Tyramine Tyramine PER: r. chimique qui fait précipiter la tyramine Observation possible en Fluorescence ou en microscopie optique

16 Immunohistochimie (limites & pièges) Fixateur Protocole de renaturation antigènique Connaître la distribution cellulaire et tissulaire de l ag (reflet de sa biologie/fonction) L antigénicité d une tumeur peut être différente de celle du tissu sain ---->!!! aux «faux négatifs» (valeur contrôles internes)

17 TTF1

18 Fixation s oppose à la déshydratation des cellules et ainsi à l altération des tissus Une mauvaise fixation peut rendre l étude cytologique impossible La fixation doit être immédiate Pas de fixateur idéal: le formol est la référence; préserve les protéines nucléaires et l ADN (ARN) Tous les fixateurs ne sont pas équivalents (morphologie, IHC, ADN, ARN, )

19 3 Most Important Aspects of Immunohistochemistry Fixation Fixation Fixation

20 Problèmes pratiques sur coupes en paraffine Quoi faire quand çà ne marche pas? Quoi faire pour que çà marche mieux? Comment faire pour être sûr que çà a marché?

21 Quelles étapes sont en cause? Fixation Démasquage Incubation AC (température, durée, concentration, lavage) Sensibilité du système de détection / amplification / révélation

22 Ponts inter et intra-moléculaires dus au formaldéhyde et renforcés par le calcium Ca ++ CH2 Ca ++ CH2 CH2 Ca ++ CH2 Ca ++ épitope

23 CD20

24 Démasquage antigénique par digestion protéolyique Trypsine Pronase, Par restauration antigénique à la chaleur Liée à la température, à la durée et au ph Micro-ondes Auto-cuiseur Bain-marie,

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26 Fixation trop longue = masquage ± réversible Fixation trop courte = effet de zone

27 But de la fixation Préservation de la morphologie. Préservation des constituants cellulaires. CD 20 congelation CD 20 paraffine

28 Intérêt des contrôles lors de la mise au point Contrôles négatifs : Omission de l anticorps primaire Remplacement par un sérum pré-immun Epuisement de l anticorps ou du sérum avec le peptide immunogène Remplacement par un anticorps de même isotype non apparenté

29 Intérêt des contrôles lors de la mise au point Contrôle positif : tissu témoin renfermant l antigène recherché Contrôle externe : Ag présent, tissu immunoréactif lors d expériences précédentes Contrôle interne : Ag présent dans le tissu normal à côté du tissu testé +++

30 Analyse du signal de la réaction antigèneanticorps Validation de sa spécificité : Est-ce la cellule d intérêt qui est marquée? La localisation cellulaire du marquage (noyau, le cytoplasme ou membrane plasmique) est-elle celle de l antigène recherché? Quantifier le marquage :+, ++ ou %

31 Artefacts & difficultés d interprétation L antigénicité d une tumeur peut être différente de celle du tissu normal plus forte : pas de problème moins forte : il faut alors essayer Démasquer ou restaurer l antigène Concentrer l anticorps I Amplifier la détection

32 Interprétation des résultats négatifs ou faibles Eliminer un problème technique Tout est négatif (contrôles +++) Vérifier la séquence des réactifs Réactifs périmés Tout est faible Lames mal lavées ou mal égouttées Substrat préparé trop tôt Incubations trop courtes

33 Si le problème technique est éliminé L antigène est présent mais dénaturé, masqué (problème de la fixation): Démasquage ou restauration antigénique (protéolyse, micro-onde, cocotte minute, bainmarie) Concentrer l anticorps Allonger la durée d incubation de l AC I Amplifier le signal

34 Si le problème technique est éliminé L antigène est présent mais en faible quantité : Concentrer l anticorps Allonger la durée d incubation de l AC I Amplifier le signal L antigène est absent : Rôle de la coupe en congélation pour le certifier

35 Choix de l anticorps Épitope +++ : Plutôt intracytoplasmique Peu glycosilé, riche en proline Empirique. Anticorps monoclonaux vs polyclonaux : Svt anti-peptide Souris, mais aussi lapin ++

36 Analyse du signal de la réaction antigèneanticorps Validation de sa spécificité : Est-ce la cellule d intérêt qui est marquée? La localisation cellulaire du marquage (noyau, le cytoplasme ou membrane plasmique) est-elle celle de l antigène recherché? Quantifier le marquage :+, ++ ou % ( ) ( ) un défi pour les pathologistes!

37 Double marquage Les solutions Si les Anticorps primaires sont d espèces différentes AC de chèvre anti IgG souris AC d âne anti IgG lapin AC monoclonal de souris AC polylonal IgG lapin

38 Immunofluorescence Svt T. directe Double marquage (colocalisation d ag) Fading Microscope particulier Morphologie Possibilité lecture au microscope confocal ---> loc sub-cellulaire

39 Immunofluoresce Immunofluoresce

40 Expression de CXCL13 par les cellules T CD10+ des T-LAI CXCL13 CD20, CD5, CD10 CD20/CXC13 CD5/CXC13 CD10/CXC13

41 Ex d applications : Immunohistochimie et tumeurs (couplage analyse morphologique et analyse de l expression d un gène) Ag de différenciation : classification/ nomenclature (Tumeurs indifférenciées); micro-métastases Ag tumoraux: peu d exemples (monotypie, ALK,..) Ag associés au pronostic (ex: bcl-2, p53,...) Ag cibles thérapeutiques (oestrogènes et NEU ds K du sein, CD117 et GIST, CD20 et LNH B, EGF-R et K colorectal)

42 Lymphome du manteau CD20 BCL2 BCL-1

43 Classification moléculaire des lymphomes B à grandes cellules A Rosenwald et al. J Exp Med, 2003 ECP, Florence, 2009

44 L immunohistochimie : une alternative aux techniques moléculaires transcriptomiques à haut débit? - Études immunohistochimiques sur puces tissulaires - Sensibilité / cdna microarray : GCB = 71 % Non-GCB = 88 % GC Non-GC C Hans et al, Blood 2004, 103:275

45 Mais résultats non confirmées par d autres études.pourquoi? Patients: - Patients heterogeneity : nodal/en, therapy, single/multicentric study, Methods : - Fixation : fixative, over/underfixation,.. - IHC optimization/standardization: pretreatment, Ab,.. - TMA or not Interpretation of the results : - lack of standard system: scoring, cut-off, algorythm - intra/inter-observer reproducibility ++ A challenge for the pathologist

46 Modifications post-traductionnelles et immunohistochimie - Protéines phosphorylées +++ apanage «historique» du WB phosphoprotéome Immunohistochimie: qq AC fiables reconnaissant spécifiquement les prot. phosphorylées - Modifications «anormales» : mutations (ex: p53, Bcl-2, )

47 Evaluation de marqueurs biologiques à l aide de techniques d analyse «à haut débit»: - «DNA array» - CGH (array) - protéomique - «Tissue-array» Repose sur cohorte de patients parfaitement annotés et collections (matériel pathologique) approriées

48 «Tissue microarray»: un nouvel outil de transfert. Phénotypage à haut débit

49 «Tissue Microarray (TMA)» - Définition - Technique «à haut débit» Réalisation de blocs multi-tissulaires (fixés, voire congelés) susceptibles de renfermer des centaines d échantillons (- 1000) différents (cancérologie++= ---- profil d expression moléculaire (protéine, ARN,..) sur de grandes séries d échantillons cliniques

50 Tissue Microarrays: A Partial Solution Nat Med 1998 Jul;4(7):844-7; Kononen et al.

51 «Tissue Microarray (TMA)» - rationnel, objectifs - Complément des analyses de transcriptome (DNA arrays) Profil d expression «à haut débit, rapide» par immunohistochie (IHC) ou hybridation in situ (HIS) à partir de nombreux tissus archivés Identification, validation de marqueurs diagnostiques, pronostiques et nouvelles cibles thérapeutiques

52 Slide from Mark A. Rubin, M.D., U. Michigan

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54 Alpha Methyl Acyl CoA Racemase

55 Combined FISH and IHC in Paraffin Alan K. Meeker, et al., Am J Pathol :

56 Tissue Microarray (puces tissulaires) Avantages - Haute résolution: Nombreux tissus examinés en une seule fois (Une lame) Economie d utilisation de matériels tissulaires précieux : De multiple prélèvements duplicate peuvent être réalisés à partir d un bloc unique (donneur) Contrôle morphologique et sélection des zones d intérêt

57 Tissue Microarray (puces tissulaires) Avantages - Uniformité des techniques (IHC, ISH, FISH...) Contrôles internes Economie des réactifs 1 seule lame -> jusqu à 1000 tissus (au lieu de 1000 lames!) Facilite les corrélations avec les données pathologiques, biologiques et cliniques sur de grandes séries

58 Tissue Microarray (puces tissulaires) limites - Perte tissulaire (décollement) Choix, pertinence des tissus inclus dans la puce (++++) base de données histologiques, biologiques base de données cliniques Lecture: cut-off Améliorations: platines automatiques Logiciels d analyse et de capture des images

59 Bacus Laboratories Inc. Slide Scanner BLISS TISSUE MICROARRAY IMAGE ACQUISITION

60 Technical Advance Software Tools for High-Throughput Analysis and Archiving of Immunohistochemistry Staining Data Obtained with Tissue Microarrays Chih Long Liu *, Wijan Prapong, Yasodha Natkunam, Ash Alizadeh *, Kelli Montgomery, C. Blake Gilks and Matt van de Rijn The Cover: Hierarchical clustering of immunostain data on a 265 core lymphoma tissue microarray, stained with 27 different antibodies.

61 Ce qui va changer Augmentation du niveau d exigences pour la prise en charge des patients Développement de traitements «spécifiques» Développement de nouveaux outils qui s imposeront au clinicien, au biologiste et.. au pathologiste et standardisation des méthodes

62 Mise en évidence d une hyperexpression «génique» (pronostic des K) Un ou qq gènes IHC HIS (?) FISH (c-erb2) «mini-puces» ADN RT-PCR (real-time) Nombreux gènes DNA array Protéomique CGH? (Tissu-array)

63 «Tissue microarray» Échantillons de routine Analyse simultanée (IHC+++, HIS, FISH) d un très grand nombre d échantillons Technique dans des conditions identiques Economie: - matériel tumoral - sondes Rapidité Interprétation (logiciels, platine motorisée,..) Validation de données du «transcriptome» Le TMA: outil de transfert et de contrôle de qualité en cancérologie. J Jacquemier et al. Bull Cancer 2003)