Chapitre IV. Les principes de dissection génétique

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1 Chapitre IV. Les principes de dissection génétique 1

2 La génétique est aussi une approche expérimentale puissante pour disséquer les fonctions biologiques, cad identifier les gènes et les protéines impliquées dans ces fonctions. On utilise pour cela des organismes modèles qui ont la particularité de se prêter aisément à l analyse génétique : Principaux organismes modèles eucaryotes Les gènes identifiés chez un organisme modèle sont souvent conservés chez des espèces plus complexes dont les mammifères isolement de mutants Gène Fonction séquence clonage du gène & analyse bioinformatique interprétation (biochimie, biologie cellulaire) Protéine 2

3 La levure : modèle d étude en biologie cellulaire des eucaryotes Fonctions à l'étude : - réplication et réparation de l ADN - transcription de l ADN et régulation - recombinaison de l ADN - maturation et traduction des ARNm - voies métaboliques (enzymes) - perméabilité cellulaire (perméases, canaux,..) - communication, réponse cellulaire (nutriments, hormones, stress,..) - cycle cellulaire (mitose, méiose) - transport intracellulaire des protéines - maturation et dégradation des protéines - peroxisomes, mitochondries - ER, Golgi, endosomes, vacuole - cytosquelette / transport vésiculaire - développement, apoptose,.. - prions isolement de mutants Gène Fonctions cellulaires séquence clonage du gène & analyse bioinformatique interprétation (biochimie, biologie cellulaire) Protéine 3

4 4

5 1. Exemple de dissection génétique chez la levure : étude du contrôle de l'expression du gène Description du système : Milieu "high " Milieu "low " - Le gène phosphatase (Pse) de l'espace périplasmique, catalyse la déphosphorylation de molécules phosphorylées -> libération de phosphate inorganique - qui est absorbé par la cellule présence dans le milieu d'un substrat chromogénique de la Pse - n'est pas exprimé si le milieu est riche en, il est hautement exprimé si le milieu est pauvre en = ion phosphate (PO 4 3- ) - test de coloration des colonies (substrat chromogénique de la Pse codée par ) 5

6 Objectif de la dissection génétique : identifier les gènes/protéines impliquées dans la régulation du gène Procédure suivie : 1 - Isolement de mutants (phénotype: gène dérégulé) 2 Classement des mutants ( combien de gènes interviennent dans la régulation de?) 3 Relations entre les gènes ainsi répertoriés 4 Clonage des gènes séquence, protéine, 6

7 1.1 Mutagenèse et isolement de mutants Pse - et Pse c - Traitement chimique mutagène de cellules sauvages haploïdes des deux signes (a et a) (donc, deux cultures et deux mutagenèses séparées) levures sauvages haploïdes - Agent mutagène = EMS = éthyl-méthane sulfonate = agent alkylant - Obtention d'un grand nombre de colonies - Réplique par tampon de velours sur milieux pauvre ou riche en (avec substrat chromogénique de Pho5) Répliques par tampon de velours - Obtention d'un grand nombre de clones de phénotype "phosphatase moins" et "phosphatase constitutive" Milieu "high " Milieu "low " mutant Pse constitutive mutant Pse - 7

8 1.2. Classement des mutants - phénotype récessif ou dominant? croisement de chaque mutant avec la souche sauvage de signe sexuel contraire et analyse du 2n hétérozygote Principe : Mutant Sauvage Phénotype du diploïde Type de mutation Pse- Pse+ Pse+ Récessive Pse- Pse+ Pse- Dominante Pse C Pse+ Pse+ Récessive Pse C Pse+ Pse C Dominante Ú Ú Ú mutation récessive = mutation de perte de fonction (complémentée par l allèle sauvage) mutation dominante = mutation de gain de fonction (non complémentée par l allèle sauvage) Résultat : 3 types de mutants sont obtenus : - mutants Pse - récessifs - mutants Pse c récessifs - mutants Pse c dominants 8

9 - Combien de gènes (une fois mutés) provoquent le phénotype Pse -? test de complémentation entre les différents mutants récessifs Pse - Principe : Mutants affectés dans le même gène n n x x 2n x x Pas de complémentation (Phénotype mutant) Mutants affectés dans des gènes différents n n x x 2n x x Complémentation (Phénotype sauvage) 9

10 Phénotype Pse des diploïdes wt wt Conclusions : Ex. : les mutations récessives Pse- : croisement deux à deux de 8 mutants (1-8, signe a) avec 10 autres mutants (9-18, signe a) et analyse du phénotype Pse : 4 classes de complémentation : I : 2, 10, 15 II : 1, 3, 7, 8, 11, 17, 18 III : 4, 5, 9, 13, 14, 16 IV : 6, 12 classe I = gène classe II = gène PHO4 classe III = gène PHO2 classe IV = gène PHO81 (il sera établi que est le gène de la Pse) (facteur positif de l'expression de ) (facteur positif de l'expression de ) (facteur positif de l'expression de ) Même type d'analyse pour les mutations récessives Pse C complémentation I, II 2 classes de classe I = gène PHO80 classe II = gène PHO85 (facteur négatif de l'expression de ) (facteur négatif de l'expression de ) 10

11 + + Pse+ Pse- Pse- Pse+ Un facteur positif active l expression de quand le milieu est pauvre en (il n agit pas quand le milieu est riche en ). Si sa fonction est perdue (mutant pho2, pho4, pho81), n est plus exprimé sur ce milieu, et ce défaut peut-être complémenté par l apport du gène sauvage codant pour ce facteur positif (le phénotype mutant est récessif) 11

12 Pse+ Pse c Pse c Pse+ Un facteur négatif empêche l expression de quand le milieu est riche en (il n agit plus quand le milieu est pauvre en ). Si sa fonction est perdue (mutant pho80, pho85), l expression de est constitutive, et ce défaut peut-être complémenté par l apport du gène sauvage codant pour ce facteur négatif (phénotype récessif) 12

13 - quid des mutants Pse C dominants? Il est probable que ces mutations altèrent l un ou l autre gène PHO ( gain de fonction) identifiés grâce aux mutations récessives. Pour tester cette hypothèse, on réalise un test de liaison génétique entre chaque mutant dominant constitutif et un représentant de chaque classe de mutants pho récessifs (croisement, isolement d'un 2n, analyse de tétrades). ex : pho4 (Pse - ) 2n mutant Pse c Résultat de l'analyse : - certaines mutations Pse C dominantes sont très étroitement liées au (et donc affectent très vraisemblablement le) gène PHO4, et les autres au gène PHO81 (ces mutations sont désignées Pho4 C et Pho81 C ). - aucune des mutations Pse C isolées n est liée à PHO2 ou à (!) DP Pse - Pse - Pse c Pse c Si la majorité des méioses aboutit à un DP, alors on Grosse peut majorité conclurede que les mutations tétrades Pse- = DP et Pse c sont génétiquement liées (uniquement phénotypes parentaux) Ex : PHO4 * * Pse - Pse C 13

14 Pse+ Pse c Pse c Pse+ Un facteur positif active l expression de quand le milieu est pauvre en. Ce facteur est inhibé quand le milieu est riche en. Si une mutation rend ce facteur insensible à cette inhibition, l expression de est constitutive. Et ce défaut n est pas complémenté par l apport du gène sauvage codant pour ce facteur positif (phénotype dominant). Conclusion : intervention de deux facteurs négatifs (Pho80, Pho85) et de trois facteurs positifs (Pho2, Pho4, Pho81), et deux des facteurs positifs (Pho4 et Pho81) sont inhibés quand le milieu est riche en cascade de régulation? 14

15 1.3. Etablissement des relations d'épistaticité entre les gènes PHO pour ordonner les éléments de régulation Pho Comment? analyse du phénotype de doubles mutants Pse - Pse c : quel phénotype l'emporte? Ex. : Phénotype du bouble mutant pho4 pho80. Comment isoler ce double mutant? Croisement entre les deux mutants et analyse des quatre ascospores issues de la méiose: si une tétrade DNP est obtenue, deux spores sont obligatoirement doubles mutantes pho4 pho80 pho4 (Pse - ) pho80 (Pse c ) pho4 PHO80 + x PHO4 + pho80 2n pho4 PHO80 + PHO4 + pho80 DNP Pse + Pse + Si dans une méiose, on trouve deux cellules Pse +, on peut déduire ce s deux que spores les deux autres sont sont obligatoirement des doubles mutants pho4 doubles pho80 mutantes (DNP) PHO4 PHO80 PHO4 PHO80 pho4 pho80 pho4 pho80 15

16 Résultat de l analyse des tests d'épistaticité : phénotype des doubles mutants Mutation Pse - Mutation Pse C Phénotype du double mutant pho2 pho80 Pse - pho2 pho85 Pse - pho2 pho4 C Pse - pho2 pho81 c Pse - pho2 est épistatique sur les quatre autres mutations pho4 pho80 Pse - pho4 est épistatique sur pho4 pho85 Pse - les trois autres mutations pho4 pho81 c Pse - pho81 pho80 Pse C pho81 pho85 Pse C pho81 pho4 C Pse C pho81 est hypostatique par rapport aux trois autres mutations 16

17 Modèle de régulation du gène (Oshima, 1982) modèle de régulation du gène (Oshima, 1982) P P Pho81 Pho81 Pho81 Pho80, Pho85 Pho80, Pho85 Pho80, Pho85 Pho4 Pho2 Pho4 Pho2 Pho4 Pho2 17

18 4. Clonage des gènes PHO : clonage par complémentation levures de génotype pho2 ura3 Ex. Mutant pour cloner Pse - le gène PHO2 (pho2, pho4, pho81) + mut ation ur a3 levures de génotype pho80 ura3 Ex. Mutant pour Pse cloner c le gène PHO80 (pho80, pho85) + mutation ura3 banque génomique : différents fragments d'adn génomique ( ura3 = mutation provoquant une auxotrophie pour l uracile ) Transformation des cellules par les plasmides (URA3+) contenant des segments d'adn génomique (banque génomique) Plasmide navette E. coli levure = plasmide puc19 1 dans lequel on a inséré : Sélection des clones URA3 + (milieu sans uracile) Milieu "low " Milieu "high " - le gène URA3 de sélection dans la levure - une origine de réplication propre à la levure mutant mutant pho2 Pse - complémenté : mutant pho80 mutant Pse c complémenté complémenté : extraction de l'adn et transformation de E. coli : sélection des clones AmpR pho2 - PHO2 PHO80 pho80-1 plasmide contenant ori, Amp R, mcs, cf. TP extractiondesplasmides: - re-transformationdesmutants - séquençage 18

19 PHO80 Pour récupérer le plasmide porteur du gène PHO80 : pho extraction et purification de l ADN - transformation de bactéries E. coli et sélection de colonies Amp R E. coli - culture de ces bactéries transformées et purification à partir de ces bactéries du plasmide milieu + ampicilline - séquençage des deux extrémités du fragment d ADN génomique inséré dans le plasmide - comparaison des séquences obtenues avec la séquence génomique complète de la levure

20 S1 Le fragment cloné est issu du chr. 15 et contient 8 ORFs : laquelle correspond au gène PHO80? S2 Test de complémentation de la mutation pho80 Chaque fragment est inséré dans un plasmide et réintroduit dans la levure oui non non oui oui non Conclusion : ORF de PHO80 séquence d aa de la protéine Pho80 20

21 Les protéines Pho impliquées dans la régulation transcriptionnelle de étant identifiées, la suite de l étude visera à comprendre leur mode d action moléculaire (par des analyses biochimiques, de biologie cellulaire,..) isolement de mutants Régulation de interprétation (biochimie, biologie cellulaire) Gène séquence Protéine clonage du gène & analyse bioinformatique 21

22 Conclusions de l'analyse : - Pho2 et Pho4 = activateurs de transcription se liant à des séquences spécifiques en amont du gène - Pho85 = kinase de type CDK (cyclindependent kinase) activée par la sousunité Pho80 (protéine de type cycline) - Le complexe Pho85-Pho80 phosphoryle Pho4 : la protéine Pho4 est alors inactive (car séquestrée dans le cytoplasme) - Pho81 : se lie au complexe Pho80-Pho85 et inhibe Pho85 (qui ne peut plus se lier à Pho4) dans les conditions de carence en. Pho81 reste lié au complexe mais sans l'inhiber si le est abondant ; Pho4 n'est alors plus phosphorylé, il migre dans le noyau est active la transcription (conjointement avec Pho2) de - Inhibition de Pho81 par le? Une molécule hautement phosphorylée (inositol-7-phosphate, IP7) se lie à Pho81 et change sa conformation > inhibition de Pho81, Pho85 reste alors actif IP7 _ 22

23 Avant les travaux de génomique fonctionnelle : Forward genetics Fonction è Mutants è Gène è Séquence On isole des mutants présentant un phénotype particulier, et on tente d'identifier le gène déficient dans ce mutant Suite aux travaux de génomique fonctionnelle (ex. isolement des 6000 mutants de la levure) : Reverse genetics Fonction ç Mutants (knockout) ç Gène ç Séquence On recherche parmi tous les mutants possibles de levure (cf. chap II, 3.6) ceux qui présentent le phénotype recherché (perte de fonction). Quand un mutant est ainsi trouvé, on sait immédiatement de quel gène il s'agit. 23

24 Plaque 96 puits > 1 mutant de levure par puit : collection d environ 4800 mutants (viables) x ~50 Chaque clone correspond à un mutant où un gène particulier (ici, YKR039w) a été éliminé du génome Test de coloration sur milieu riche ou pauvre en -> identification de tous les gènes impliqués dans le contrôle de l expression du gène 24