SCM6052/BIM6027 et EXMD604 Angiogenèse / Vasculogenèse

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1 SCM6052/BIM6027 et EXMD604 Angiogenèse / Vasculogenèse Jean-Philippe Gratton, Ph.D. Département de Pharmacologie Université de Montréal jean-philippe.gratton@umontreal.ca n n n n n Plan du cours Définitions et facteurs de croissance Vasculogenèse n Développement vasculaire embryonnaire n Cellules progénitrices n Spécification artério-veineuse Angiogenèse n Physiologique n Pathologique Artériogenèse n Remodelage vasculaire Angiogenèse et perméabilité vasculaire n Production du monoxyde d azote n Jonctions intercellulaires n NO et perméabilité vasculaire 1

2 Les cellules endothéliales Rôles et fonctions: n Sécrètent des hormones qui contrôlent la pression sanguine n Vasodilatateurs n Vasoconstricteurs n Participent à la réponse inflammatoire via l attachement des globules blancs aux sites d inflammation n Initient la formation de nouveaux vaisseaux sanguins: ANGIOGÉNÈSE Capillaire Chez un adulte, l endothélium fait: g m 2 2

3 Artériole Membrane basale n n Les composantes de la membrane basale sont synthétisées par les cellules endothéliales: n Collagène, Laminine n Glycoaminoglycans tel l héparan sulfate n Fibronectine, thrombospondine, facteur de von Willebrand, etc. Les cellules endothéliales expriment des intégrines qui se lient à certaines composantes de la membrane basals n Collagène, laminine, fibronectine, 3

4 Développement et maturation vasculaire Mécanismes de formation des vaisseaux sanguins 4

5 Facteurs angiogéniques et vasculogéniques La famille des VEGF 5

6 VEGF receptors VEGFR-1 (Flt-1): High affinity for VEGF, low tyrosine kinase activity. Decoy VEGF receptor or suppressor of VEGFR-2 signaling. VEGFR-2 (KDR/Flk-1): Mediates the major growth and endothelial permeability actions of VEGF. VEGFR-3 (Flt-4): Lymphatic development. VEGF signaling in endothelial cells VEGF VEGFR-2 Raf-1 MEK Erk1/2 DAG c-src PLCγ PI-3 K Akt MEKK3 MKK3/6 p38 MAPK PKC IP3 Proliferation Ca 2+ enos Survival Migration NO 6

7 Régulation de la morphogénèse vasculaire, maintenance et remodelage par les RTK et leurs ligands Remodelage vasculaire 7

8 Angiopoïetines et récepteurs Tie Tie receptors: new modulators of angiogenic and lymphangiogenic responses Nina Jones, Kristiina Iljin, Daniel J. Dumont and Kari Alitalo Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, (April 2001) Signalisation intracellulaire Tie2 Tie receptors: new modulators of angiogenic and lymphangiogenic responses Nina Jones, Kristiina Iljin, Daniel J. Dumont and Kari Alitalo Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, (April 2001) 8

9 J- 4.0 J- 6.0 J- 7.0 Développement vasculaire embryonnaire Coultas et al. Nature

10 Ilots sanguins 10

11 Cellules progénitrices Molecules expressed preferentially in arterial and venous endothelial cells Gene Species Artery Alk1 Mouse CD44 Mouse Connexin37 Mouse Connexin40 Mouse CXCR4 Mouse deltac Zebrafish Delta-like 4 Mouse Depp Mouse ephrinb2 Zebrafish, mouse, chick gridlock Zebrafish IGFBP-5P Mouse Neuropilin-1 Mouse, chick Notch4 Mouse Notch5 Zebrafish Tbx20 Zebrafish Unc5b Mouse Vein APJ Mouse COUP-TFII Mouse EphB4 Zebrafish, mouse, frog Flt4 Zebrafish Neuropilin-2 Mouse, chick Tie2 Chick 11

12 Spécification artério-veineuse Ephrines 12

13 Possible sites and mechanisms of Eph/ephrin function in the developing vasculature. Angiogenèse 13

14 Mécanisme de l angiogénèse Principaux activateurs et inhibiteurs de l angiogenèse Activateurs Membres de la famille VEGF Récepteurs du VEGF Angiopoïétine-1 et récepteur Tie2 PDGF-BB et ses récepteurs TGF-β1, endogline et les récepteurs du TGF-β FGF, HGF, MCP-1 Intégrines α v β 3, α v β 5, α 5 β 1 Fonctions Stimulent l angiogenèse, la vasculogenèse, la perméabilité vasculaire et l adhésion des leucocytes; VEGF-C : stimule la lymphangiogenèse; PIGF : rôle dans l angiogenèse pathologique VEGFR-2; récepteur induisant un signalement angiogénique; VEGFR-3 : récepteur induisant un signalement lymphangiogénique Ang1 : stabilise les vaisseaux en resserrant l interaction endothéliale-muscle lisse; inhibe la perméabilité Recrute les cellules du muscle lisse et péricytes Stabilise les vaisseaux en stimulant la production de matrice extracellulaire Stimulent l angiogenèse (FGF, HGF) et l artériogenèse (FGF, MCP-1) Récepteurs pour les macromolécules et métalloprotéinases de matrice (MMP2) VE-cadhérine, PECAM (CD31) Molécules de la jonction endothéliale; essentielles à la survie des cellules endothéliales; des anticorps peuvent bloquer l angiogenèse tumorale Éphrines Activateur du plasminogène, métalloprotéinases de matrice Inhibiteur de l'activateur du plasminogène (PAI-1) Synthéase du monoxyde d azote, cyclooxygénase Autres activateurs Régule la spécification artérielle/veineuse Protéinases impliquées dans la migration cellulaire et le remodelage de la matrice; libèrent le bfgf et le VEGF de la matrice; activent le TGF-β1; génèrent l angiostatine Stabilise les nouveaux vaisseaux en prévenant la dissolution de la matrice; mauvais pronostic de cancer Le monoxyde d azote et les prostaglandines stimulent l angiogenèse et la vasodilatation; des inhibiteurs de Cox2 inhibent l angiogenèse tumorale Interleukine 8; leptine; AC133 (récepteur orphelin impliqué dans la différentiation des angioblastes); chimiokines (rôle pléitropique dans l angiogenèse); certains inhibiteurs de la différentiation cellulaire 14

15 Principaux activateurs et inhibiteurs de l angiogenèse Inhibiteurs VEGFR-1, VEGFR-1 soluble et NRP-1 soluble Fonctions Réquisitionne le VEGF, VEGF-B et PIGF Angiopoïétine-2 Antagoniste de Ang1 : induit la régression des vaisseaux en absence d un signal angiogénique Thrombospodine-1 (TSP-1) Protéine de matrice extracellulaire; inhibe la migration, la croissance, l adhésion et la survie des cellules endothéliales; la protéine similaire TSP-2 inhibe aussi l angiogenèse Meth-1, Meth-2 Angiostatine et Related plasminogen kringles Inhibiteurs contenant des domaines montrant des similitudes avec les métalloprotéinases, les thrombospondines et les disintégrines Fragments protéolytiques du plasminogène; inhibent la migration et la survie des cellules endothéliales Endostatine Fragment du collagène de type XVIII, inhibe la migration et la survie des cellules endothéliales Angiogenic sprouting 15

16 Sélection des Tip et Stalk Cells VEGF migration compétition et sélection Carmeliet P et al. (2009) Nat Rev Clin Oncol L angiogénèse et les maladies humaines n Cancer 16

17 Hypoxia-inducible factor Thérapies anti-angiogéniques 17

18 Approche Anti-Angiogénique: Dr Judah Folkman n Suggère que les cellules tumorales ne peuvent se développer sans leur propre réseau sanguin The ideas are simple, but getting them figured out is very complicated DIFFUSION PERFUSION TAF Folkman, et al. NEJM 1971 Copyright [1971] Massachusetts Medical Society. All rights reserved Bevacizumab (Avastin ): rhumab VEGF n n n n Anticorps Monoclonal anti-vegf Humanisé Recombinant" 93% humain, 7% murin" Reconnaît toutes les isoformes du VEGF, K d = 8 x M" Demi-vie terminale: jours" 18

19 Avastin cible le VEGF n Avastin se lie à toutes les isoformes connues du VEGF, prévenant Avastin VEGF n n une interaction avec ses récepteurs l activation en aval des voies de signalisation X n Ce qui conduit à la régression de la vascularisation, laissant la tumeur dormante P P X P P Développement Prolifération Migration Survie Mode d action d Avastin: un effet dynamique EFFETS RAPIDES EFFETS CONTINUS 1 Régression 2 Normalisation 3 Inhibition Diminue la taille de la tumeur Améliore la distribution de la CTx Supprime la croissance de nouveaux vaisseaux Supprime la repousse via l amoncellement de vaisseaux 19

20 Étude Phase III IFL ± BV en CCRM plan de l étude (AVF2107g) Bolus IFL + placebo (n=412) PD Pas de BV jusqu à PD CCRM n ayant jamais été traité Bolus IFL + bevacizumab (n=403) PD BV jusqu à PD 5-FU/LV + bevacizumab (n=110) PD BV jusqu à PD IFL bolus 5-FU 500mg/m 2 leucovorin 20mg/m 2 irinotecan 125mg/m 2 toutes les 4/6 semaines 5-FU/LV bolus 5-FU 500mg/m 2 leucovorin 500mg/m 2 toutes les 6/8 semaines Bevacizumab 5mg/kg toutes les 2 semaines Hurwitz H, et al. N Engl J Med 2004;350: Survie globale: 4.7 mois 20

21 PFS: 4.4 mois Normalisation de la vascularisation tumorale Normalisée Anormale 21

22 Anti-VEGF et métastases? Effets secondaires des thérapies Anti-VEGF 22

23 L angiogénèse et les maladies humaines n Maladies cardiovasculaires Revascularisation d un tissu Infarctus du myocarde Membres inférieurs (Diabète) Redistribution du flot 23

24 Forces de cisaillement Forces de cisaillement 24

25 Artérialisation et flot sanguin Artériogenèse 25

26 Perméabilité vasculaire et croissance tumorale Microcirculation functions to provide rapid exchange of nutrients and waste products between blood and tissues. The passage of circulating macromolecules, such as plasma proteins, is severely restricted. Tumor microvasculature is 3 to 5 times leakier to macromolecules than normal tissues. 3 INTER-CELLULAR PASSAGE Junctions Caveolae & Vesicles VEGF is thought to be responsible for the 2 TRANSCYTOSIS hyperpermeable state of tumor vessels. 4 MEMBRANE TRANSPORTERS Basal lamina Endothelial cell 1 DIFFUSION Types de jonctions 26

27 Jonctions intercellulaires - Jonctions serrées - Rôle de barrière - Basolatérale et apicale - Électrolytes - Distribution hétérogène le long de l arbre vasculaire - Artères > veines - Important pour la BHE - Jonctions GAP - Communication intercellulaire Jonctions intercellulaires (suite) - Jonctions adhérentes - Régulation de la perméabilité vasculaire aux macromolécules et aux cellules inflammatoires - Essentielles à l angiogénèse - Jouent un rôle important dans l inhibition de contact et l apoptose 27

28 Endothelial nitric oxide synthase (enos) L-Arginine enos NO Vasodilatation EC migration EC and SMC proliferation Vascular permeability NO signaling Ach EC M Ca 2+ L-Arg enos L-NAME NO + citrulin VSMC GTP GC cgmp PKG 28

29 Signalisation du NO L-arginine O 2 Ca 2+ ACh G ADP Endothélium O 2 Ca 2+ Calmoduline NOS L-NAME L-arginine NADPH L-citrulline NO Sildenafil PDE5 Ca 2+ Relaxation GTP 5 -GMP GMPc NO GCs PKG BM Muscle lisse vasculaire enos activation by VEGFR2 enos Hsp90 L-Arg PO 4 NO P Akt P PI3P p85 p110 PO 4 Y801 PLCγ PO 4 Y1175 Ca 2+ IP 3 PO 4 Y1214 Garcia Blanes et al. J. Biol. Chem

30 NO and VEGF-mediated angiogenesis NOS inhibitors block VEGF induced endothelial cell migration and proliferation. enos knockout mice display reduced VEGF driven angiogenesis. Reduced VEGF dependent increase in vascular permeability by NOS inhibitors and in enos knockout mice Gratton et al. Cancer Cell Endothelial adherens junctions To induce loss of cell-cell contact VEGF: - stimulates VE-cadherin internalisation - induces VE-cadherin complex tyrosine phophorylation - dissociates the VE-cadherin/β-catenin complex We hypothesize that NO can directly modulate the adherens junction complex. 30

31 Cysteine S-nitrosylation (SNO) Biotin-switch (SNO) sgc Heme VEGF induces S-nitrosylation of β-catenin 31

32 enos is essential for S-nitrosylation of β-catenin Identification of S-nitrosylated Cys residues on β-catenin 32

33 Cys619 of β-catenin is a target of NO NO-dependent dissociation of VE-cadherin and β-catenin 33

34 S-nitrosylation of β-catenin regulates VEGF-induced endothelial permeability Endothelial cell monolayer Thibeault et al. Mol Cell 2010 n Summary (II) S-nitrosylation of β-catenin on Cys619 following enos activation by VEGF could explain the regulatory actions of NO on adherens junctions and increase in endothelial permeability. Thibeault et al. Molecular Cell,

35 A model for enos activation BK Caveolin hsp90 enos NOSTRIN NOSIP BK Dyn Porin enos S CaM 1177 PO 4 hsp90 Akt L-Arg NO Less active Stimuli Ca 2 + sgc Active cgmp Antennapedia comme transporteur de peptides Extracellular Cytoplasm AP Caveolin Caveolin-1 AP = RQIKIWFQNRRMKWKK Cav = DGIWKASFTTFTVTKYWFYR Cav-X = WGIDKAFFTTSTVTYKWFRY N C 35

36 Vascular permeability and angiogenesis Increased permeability of the microcirculation functions to provide a rapid exchange of nutrients and waste products between blood and tissues. The hyperpermeable state of the vasculature is thought to favor the deposition of plasma proteins (fibrin, collagen, ) which contributes to the angiogenic environment. VEGF is thought to be responsible for the hyperpermeable state of angiogenic vessels. INTER-CELLULAR PASSAGE Junctions Caveolae & Vesicles TRANSCYTOSIS MEMBRANE TRANSPORTERS Basal lamina Endothelial cell DIFFUSION La perméabilité vasculaire en tant que cible thérapeutique A B C 36

37 Cavtratin réduit la croissance tumorale chez la souris Réduction du nombre de vaisseaux sanguins dans les tumeurs traitées à AP-Cav A B 37

38 Réduction de la vascularisation dans les tumeurs des souris enos -/- Inhibition of enos in the tumor vasculature reduces the hyperpermeable state of tumor vessels This hyperpermeable state is essential for tumor growth and angiogenesis Targeting this characteristic trait of the tumor vasculature might be a novel and specific approach to reduce tumor growth. 38