La microscopie optique. Nicolas Sandeau Maître de Conférences

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1 La microscopie optique Nicolas Sandeau Maître de Conférences

2 A quoi ça sert? Observer un objet, un phénomène avec une bonne résolution spatiale (voire temporelle) sans trop de perturbations (innocuité). L instrument doit être sensible et la mesure (l image) contrastée. Le plan Les contrastes Les microscopies de fluorescence La microscopie confocale Augmenter la résolution Les microscopies non linéaires

3 Les 1 er microscopes Vers 188, des détails aussi petits que.2 µm sont déjà accessibles. Microscope Carl Zeiss 1891

4 Principe du microscope Imageur Vers caméra Vers l oeil Source en Epi-illumination Source en transmission Détection en forward

5 Principe du microscope Oculaire Image intermédiaire Oculaire Plan image 16 mm Lentille de Telan Objectif Objectif Spécimen Spécimen

6 Les contrastes en microscopie

7 Contraste en microscopie D où vient le contraste? Absorption, diffusion, réfraction, réflexion. Variations d intensité, de couleurs, de netteté

8 Contraste en microscopie Condenseur Caméra Lampe (incohérent) Filtre occultant Fond noir Filtre déphasant Contraste de phase

9 Contraste en microscopie Condenseur Caméra Lampe (incohérent) Filtre occultant Fond noir Filtre déphasant Contraste de phase

10 Contraste en microscopie Condenseur Caméra Lampe (incohérent) Filtre occultant Fond noir Filtre déphasant Contraste de phase e i'

11 Microscopie sur fond noir Objectif Rayons diffractés Rayons non-diffractés Spécimen Condenseur Filtre annulaire Lumière blanche OPI/OPI_fr_M3_C4/co/Contenu_K22.html

12 Contraste de phase (Zernike prix Nobel 1953) Diaphragme annulaire Lame de Phase Plan Image Source Ouverture du condenseur Plan focal arrière de l objectif

13 Contraste de phase (Zernike prix Nobel 1953) Image de la phase

14 Microscope polarisant P Mesure de la biréfringence A cos µ 1 sin µ A cos µ 1 sinµe i' A E sin(2µ)(e i' sin µ 1 cos µ A 2 I I I sin 2 (2µ) sin 2 ('=2)

15 Microscope polarisant P Mesure du pléochroïsme cos µ 1 sin µ A cos µ 1 sinµe A I I cos 2 µ + sin 2 µe 2

16 Contraste par interférométrie Image du relief

17 Microscope DIC Differential Interference Contrast Image du gradient de la phase ± < r esolution I/ 1 + cos( ' + ' ) gradient de phase

18 DIC ou Contraste de phase? Objets Images DIC Images de la phase Contraste de phase insensible aux pbs de polarisation boite de Petri DIC utilisable avec des objectifs à forte NA meilleur résolution

19 Contraste de fluorescence Excitation Émission Décalage de Stokes Diagramme énergétique de Jablonski Intérêts de ce contraste Possibilité de filtrer simplement le faisceau d excitation et ne détecter que l émission Découplage de l excitation et de l émission Rendement de fluorescence Marquage spécifique Défauts Photobleaching Toxicité Particularités Temps de désexcitation Transfert d énergie

20 Les luminophores Fluorophores exogènes intercalables, greffables(spécifique) Protéines chimériques (GFP ); Billes fluorescentes (plus lumineux mais plus gros); Fluorophores endogènes (moins lumineux); Nanocristauxde semi-conducteur (plus lumineux, moins de photobleaching mais blinking! et pb de greffache et de phototoxicité. Nano-diamants (plus stables, plus lumineux )

21 Contraste de fluorescence (spectral) 2 (fausses)couleurs Dichroïque Filtre DAPI Filtre rouge Cellules de foie détection Excitation Miroir dichroïque filtres Excitation à 36nm Émission Noyau (DAPI) Cytosquelette détection

22 Contraste de fluorescence (temps de vie) FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) Deux méthodes (Cf F. Sureau): Time domain Frequency domain Permet de différencier 2 fluorophores qui ont même spectre d émission Images Sandrine Lévêque-Fort - Lab.de Photophysique Moléculaire

23 Contraste en microscopies cohérentes Génération de Second Harmonique(SHG) ~P 2! = Â (2) ~E! : ~E! uniquement sur des matériaux non-centrosymétriques! ω 2ω ω ωf Artère de rein fibrotique Rouge:2PEF Vert: SHG=>collagène SHG 2PF Intensity (counts) THG SHG TPF Génération de Troisième Harmonique(THG) efficace sur les interfaces! ~P 3! = Â (3) E ~! : E ~! : E ~! wavelength (nm) ω 3ω THG Image d embryon de drosophile W. Supattoet al., PNAS (25)

24 Les microscopies de fluorescence

25 Deux modes d imagerie: Microscopies de fluorescence Échantillons spatialement incohérents! Condenseur Imagerie en champ large Lampe (incohérent) Caméra Imagerie en mode confocal y x z Faisceau pompe (cohérent) Miroir dichroïque Trou confocal Photodiode

26 Microscopies de fluorescence Échantillons spatialement incohérents! Deux modes d imagerie: La profondeur de champ d z = n NA 2

27 Microscopies de fluorescence Résolution vs Localisation La localisation latérale est limitée par le bruit de l ordre du nm avec 1 émetteur! Single Particule Tracking(SPT) New directions in single-molecule imaging and analysis, W. E. Moerner, PNAS 14, , 27 La résolution latérale est limitée par la diffraction de l ordre de =2. µ J1 (k NA M r) k NA M r 2

28 Microscopies de fluorescence Résolution vs Grandissement Image à faible grandissement Image grandie 4 fois Le grandissement M = f t f o Image grandie 4 fois et 2 fois plus résolue La résolution 1:22 2NA Le grandissement est important mais l ouverture numérique de l objectif l est beaucoup plus!

29 Microscopies de fluorescence Résolution vs Grandissement résolution de l objectif M 1; 22 2NA Attention à la taille du pixel! Il faut adapter le grandissement à la taille du détecteur!

30 Microscopies de fluorescence Mesure de l orientation 3D x z excitation emission camera excitation emission camera Conservation de l information sur l orientation de l émetteur à travers le microscope λ=525 nm NA=1,3 n=1.518 m=4

31 Imagerie défocalisée x z excitation camera Y ( µm) (A.U.) dipole emission -4 focal plane Conservation de l information sur l orientation de l émetteur à travers le microscope X ( µm) Image du dipole x z excitation camera Y ( µm) (U.A.) dipole emission -4 focal plane Mais information difficile à lire! X ( µm) Image du dipole

32 Imagerie défocalisée excitation emission camera Y ( µm) (A.U.) -1 X ( µm) 1 x excitation 1 mm z camera emission focal plane L imagerie défocalisée pour lire cette information! M. Böhmer& J. Enderlein, JOSA B 2 (23) Y (µm) X (µm) «imagedéfocalisée» du dipole (A.U.)

33 Imagerie défocalisée A A D. Patra, I. Gregor, J. Enderlein, J. Phys. Chem. A 18 (33) p (24) B E. Toprak et al., PNAS13(17) p (26)

34 Les microscopies de fluorescence à balayage

35 Microscopie confocale de fluorescence f obj NA Laser beam f l φ n Photodetector Dichroic mirror Main parameters of the microscope : NAand the ratio φ/m of the excitation : mode, wavelength, polarization, shape of the beam of the emission : wavelength 3D-Resolutionis defined by a volumetric function depending on the excitation, emission and collection parameters.

36 Volumes d excitation (EEF) Excitation Efficiency Function(EEF) NA=1,4 n=1,518 λ 1 =4nm E. Guiot, PhD Orsay Univ. (21) EEF = Carte 3D de l intensité focalisée (1PF) = Carte 3D de I 2 (2PF) meilleure confocalité LASER beam

37 Volumes de collection (CEF) Collection Efficiency Function(CEF) z (nm) CEF = Image 3D du trou confocal = r (nm) Carte 3D de l intensité détectée en fonction de la position 3D de l émetteur individuel uniformément éclairé objective Tube lens pinhole Fluorescence

38 Volumes de collection (CEF) Collection Efficiency Function(CEF) z (nm) CEF = Image 3D du trou confocal = r (nm) Carte 3D de l intensité détectée en fonction de la position 3D de l émetteur individuel uniformément éclairé objective Tube lens pinhole Fluorescence

39 Volumes de collection (CEF) Collection Efficiency Function(CEF) z (nm) CEF = Image 3D du trou confocal = r (nm) Carte 3D de l intensité détectée en fonction de la position 3D de l émetteur individuel uniformément éclairé objective Tube lens pinhole Fluorescence

40 Volumes de collection (CEF) Collection Efficiency Function(CEF) z (nm) CEF = Image 3D du trou confocal = r (nm) Carte 3D de l intensité détectée en fonction de la position 3D de l émetteur individuel uniformément éclairé objective Tube lens pinhole Fluorescence

41 Volumes de détection (DEF) Detection Efficiency Function(DEF) Focusing Emission 8 2 z (nm) 6 Excitation Collection Detection r (nm) EEF Resolution CEF DEF=EEFX CEF Focused beam Image of the pinhole Fluorescent sample LASER beam Fluorescence

42 Augmenter la résolution? EEF CEF DEF 8 6 EEF CEF DEF Axe X ( µm) Axe X ( µm) NA=,6 φ/m=1µm λ p =488nm λ f =525nm NA=,6 φ/m=,3µm λ p =488nm λ f =525nm Le trou confocal doit être adapter à la fonction d Airy 1; 22 R = M 2NA

43 Augmenter la résolution? EEF CEF DEF 8 6 EEF CEF DEF Axe X ( µm) Axe X ( µm) NA=,6 φ/m=1µm λ p =488nm λ f =525nm NA=,6 φ/m=,3µm λ p =488nm λ f =525nm Le trou confocal doit être adapter à la fonction d Airy 1; 22 R = M 2NA

44 Augmenter la résolution des microscopes confocaux

45 Résolution axiale TIRF microscopy (Total Internal Reflection Fluorescence) I(z) = I e z=d d = 4¼ p n 2 12 sin 2 µ n 2 2 d quand λ ou θ

46 Résolution axiale TIRF microscopy (Total Internal Reflection Fluorescence)

47 Résolution axiale Le θ-microscope EEF CEF DEF z X = z z

48 Résolution axiale: le θ-microscope EEF DEF CEF Laser beam Photodetector Pb d encombrement et de support d échantillons!

49 Résolution axiale: 4π-microscopie L Photodetecteur Sténopé Fluorescence LASER LASER Fluorescence M Lame semiréfléchissante Filtre Notch M M L Objectifs Miroir dichroïque (b) L Sténopé Objectifs (a) (a) S. W. Hell, EP ( ) (b) C. J. R. Sheppardet al. Optik87(3) (1991)

50 Résolution axiale: 4π-microscopie L Photodetecteur Sténopé Fluorescence LASER LASER Fluorescence M Lame semiréfléchissante Filtre Notch M M L Objectifs Miroir dichroïque (b) L Sténopé Objectifs (a) (a) S. W. Hell, EP ( ) (b) C. J. R. Sheppardet al. Optik87(3) (1991)

51 Résolution axiale : 4π-microscopie L Photodetecteur Sténopé Filtre Notch Fluorescence Lame semiréfléchissante M M Objectifs (a) (a) S. W. Hell, EP ( ) (b) C. J. R. Sheppardet al. Optik87(3) (1991) (c) A. Egneret al. Trends in CellBiology15(4) 25 (c) Fibres d actines

52 CEF d un 4π-microscope Fluorophore dipolaire Foyers Axe optique (z) λ=525 nm NA=1,3 n=1.518 m=4 φ=2 µm

53 CEF d un 4π-microscope Dipôle fictif cohérent Fluorophore dipolaire Axe optique (z) Foyers λ=525 nm NA=1,3 n=1.518 m=4 φ=2 µm

54 Résolution axiale: le 4π-microscope Lobes secondaires trop intenses Pas de gain sur la résolution latérale Images of a pair of actin fibers A. Egner et al. Trends in Cell Biology15(4) 25

55 4π-microscopie et excitation 2PE EEF= Carte 3D du carré de l intensité du faisceau pompe focalisé Excitation Émission Régime d absorption à 2 photons λ pompe1 =488 nm λ pompe2 =2x488 nm λ fluo =525 nm β=.1 Polarisation selon X NA=1,3 n=1.518 Φ=2 µm m=4

56 4π-microscopie et excitation 2PE EEF= Carte 3D du carré de l intensité du faisceau pompe focalisé Excitation Émission Régime d absorption à 2 photons λ pompe1 =488 nm λ pompe2 =2x488 nm λ fluo =525 nm β=.1 Polarisation selon X NA=1,3 n=1.518 Φ=2 µm m=4

57 4π-microscopie et excitation 2PE Excitation Émission Lobes secondaires moins intenses Régime d absorption à 2 photons λ pompe1 =488 nm λ pompe2 =2x488 nm λ fluo =525 nm β=.1 Polarisation selon X NA=1,3 n=1.518 Φ=2 µm m=4 Perte sur la résolution latérale

58 Résolution latérale: le 4π Fluorophore Focus optical axis (z) λ=525 nm φ=2 µm NA=1,3 n=1.518 m=4 S. Hell, Double-confocal scanning microscope, European Patent EP (1992, filed dec ).

59 Résolution latérale: le 4π Coherent dipole Fluorophore Focus optical axis (z) λ=525 nm φ=2 µm NA=1,3 n=1.518 m=4 S. Hell, Double-confocal scanning microscope, European Patent EP (1992, filed dec ).

60 Résolution latérale: le 4π Fluorophore Coherent dipole Focus optical axis (z) λ=525 nm φ=2 µm NA=1,3 n=1.518 m=4 N. Sandeau, H. Giovannini, J. Opt. Soc. Am. A 23, (26).

61 Résolution 3D: le STED Stimulation Excitation Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15): (2).

62 Principe des microscopies non linéaires et/ou cohérentes

63 Signaux non linéaires Fluorescence Signaux cohérents Intensité (U.A.) ω 1 ω f ω 2 ω 2 Fluorescence Fluorescence Fluorescence excitée à 1 ph. excitée à 2 ph. excitée à 3 ph. 1PF 2PF 3PF THG SHG ω f ω 3 ω 3 ω 3 Fluo ω f ω ω 2ω Génération 2 nd Harmonique. SHG Uniquement sur les objets non centrosymétriques (Collagène) ω ω ω 3ω Génération 3 ème Harmonique. THG Efficace sur les interfaces (membranes) Longueur d onde(nm)

64 Signaux non linéaires ω 2 ω 1 ω f ω f ω 2 Avantages: confocalité pénétration dans les tissus (-de diffusion) + grand écart entre excitation et émission Inconvénients: sources à impulsions courtes (Prix, spectre ) 1PF 2PF 4nm continu 8nm impul- sionnel W. R. Zipfel 1 photon et al. Nature Biotech. 2 photons 21(23)

65 Signaux non linéaires ω 2 ω 1 ω f ω f ω 2 Avantages: confocalité pénétration dans les tissus (-de diffusion) + grand écart entre excitation et émission 1PF 2PF Inconvénients: sources à impulsions courtes (Prix, spectre ) Rein de singe profondeur 6 µm exc 75nm, NA 1.2 V. E. Centonze et al. Biophys. J. 75 (1998)

66 Signaux non linéaires ω 2 ω 1 ω f ω f ω 2 Avantages: confocalité pénétration dans les tissus (-de diffusion) + grand écart entre excitation et émission Inconvénients: sources à impulsions courtes (Prix, spectre ) 1PF 2PF 1PE 95 nm 35 nm 2PE Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marqué Excitation à 8 nm

67 Signaux non linéaires ω 2 ω 1 ω f ω f ω 2 Avantages: confocalité pénétration dans les tissus (-de diffusion) + grand écart entre excitation et émission 1PF 2PF Inconvénients: sources à impulsions courtes (Prix, spectre )

68 Signaux Cohérents ω ω 2ω Sur objet non centro-symétrique (signal cohérent) Sensible à l ordre et à l orientation des molécules SHG Spectre 2PE sur tissu pulmonaire non marqué Excitation à 83 nm SHG image of fibroblast cell labeled by Di8 LPQM Collaboration with The Ben-Gurion University (L. Amire, R. Marx)

69 Microscopies cohérentes : ex la SHG Local excitation field E ( x, y, z) ω Coherent induced dipoles P NL, 2ω ( x, y z) P NL, (2) ( x, y, z) = χ : E ( x, y, z) : E ( x, y z) 2ω 2ω ω ω

70 Microscopies cohérentes : ex la SHG P NL, (2) ( x, y, z) = χ : E ( x, y, z) : E ( x, y z) 2ω 2ω ω ω Potassium Titanyl Phosphase - KTiOPO4 We define the KTP orientation by the Euler angles (θ, ϕ, ψ) x z θ ϕ 2 X 3 ψ Z Y 1 y χ χ χ χ (2) 15 (2) 24 (2) 31 (2) pm / V 3.6 pm / V 2.5 pm / V 4.4 pm / V (2) χ pm /VV 33 χ (2) of massive KTP Le signal de SHG dépend du champ d excitation et de l objet (orientation, taille )!

71 Microscopies cohérentes : ex la SHG x nm x nm x1 3 x nm x z nm -2 z nm z nm y nm y nm x1 3 y nm x z nm z nm 1 nm long side 7 nm long side -2 2 z nm 1 nm long side KTP along X axis Euler angles: θ=9,, ϕ=, ψ= Intensity (A.U.) Forward Epi x 1 Epi/Forward sides length (nm) 4