Aspects métaboliques du fonctionnement du myocyte cardiaque

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1 Muscle strié cardiaque (section longitudinale) Aspects métaboliques du fonctionnement du myocyte cardiaque Danielle Feuvray Université Paris XI UMR CNRS 8078 (X 400) La cellule musculaire cardiaque qui est caractérisée par une activité contractile permanente requiert un apport énergétique ou, plus exactement, un flux d énergie, élevé. Ce flux élevé et permanent d énergie (assuré par la synthèse de molécules d ) ne peut être entretenu que par un métabolisme de type oxydatif. Le caractère oxydatif du métabolisme du myocarde est illustré par l abondance des mitochondries dans les cardiomyocytes (5 à 40% du volume cellulaire, 1 mitochondrie/sarcomère). mito 1

2 Transfert intracellulaire de l énergie Cr CK ANT PCr ADP CK La production mitochondriale de l implique la notion de transfert de l énergie vers le ou les lieu(x) d utilisation, principalement les myofibrilles. Le système efficace qui intervient est celui qui met en jeu la phosphocréatine (PCr) et l enzyme créatine kinase (CK). La CK catalyse une réaction entre la PCr (qui agit comme une "réserve" de groupements phosphates riches en énergie) et l ADP, pour former de la Cr et de l. GLUCOSE AG(NE) (en C16 et C18) Normoxie "The heart is a true metabolic omnivore", H. Taegtmeyer Substrats métaboliques en condition de normoxie Diabète Ac. Gras Lactate L utilisation des substrats est fonction des conditions nutritionnelles et hormonales Dans les conditions normales où un flux coronaire adéquat assure un approvisionnement optimal en substrats, l oxydation des acides gras (à LC) représente au minimum 60 % de la consommation de O2, contre 16 à 18 % pour le lactate et le glucose, et environ % pour les corps cétoniques. Après un repas riche en lipides, en situation de jeûne ou chez le diabétique, les AGs représentent le substrat essentiel du myocarde. Exercice physique: le lactate sanguin est utilisé. Ca 2 NCX Na H Pi 2 NHE MgADP Na LDH H LACTATE MCT Lac Na HCO Glut1 Glut4 FAT/CD6 Sarcolemme AG(NE) TG 6P Glycogène FABPs Glycolyse PFK GAPDH AcylCoA Mg 2 CPT1 CO 2 PDHa CPT2 PD active Cycle de Krebs AcylCoA βoxydation mitochondriale NADH & FADH 2 O 2 PHOSPHORYLATION OXYDATIVE H 2O ADP Pi Activité contractile Cardiomyocyte 2

3 GLUCOSE AG(NE) C est un cycle de Glut1 réactions Glut4 mitochondriales dit cycle de l acide citrique Sarcolemme Ca 2 (ou encore cycle des acides tricarboxyliques, TCA, ou cycle de Krebs), qui fournit, à partir de l acétyl CoA produit par la dégradation AGL TG des substrats métaboliques, les 6Péquivalents Glycogène réducteurs (NADH & FADH2) Na qui vont alimenter, en présence d O2, la phoshorylation oxydative. PFK Glycolyse GAPDH AcylCoA H Celle ci aboutit à la condensation d ADP et de phosphate inorganique Pi 2 MgADP Mg 2 CPT1 pour régénérer l. NHE Na Le cycle de l acide citrique est la voie commune finale de l oxydation LDH des substrats ou molécules énergétiques. H CO 2 LACTATE MCT PDHa Lac CPT2 AcylCoA Na βoxydation HCO mitochondriale Cycle NADH L acétyl CoA fournit l acétate de & qui se combine à l acide oxaloacétique Krebs FADH 2 pour former le citrate, premier élément d un cycle de réactions qui constitue le O 2 PHOSPHORYLATION OXYDATIVE H 2O cycle des acides tricarboxyliques. ADP Pi Activité contractile NCX PD active Comment les différentes voies d utilisation de ces substrats sontcontrôlées et régulées? Exemples : elles (charge) travail cardiaque contrôle la vitesse d utilisation des substrats. des changements coordonnés d activités enzymatiques régulent le métabolisme des substrats. autres Insuline et métabolisme du glucose Insuline Insuline et transport du glucose Insuline Le récepteur de l insuline est une enzyme allostérique transmembranaire. La liaison de l insuline induit l autophosphorylation et l activation d un domaine tyrosine kinase (sur la face cytoplasmique de la sousunité β). Mb Glut1 intervient principalement dans le transport basal de glucose. La translocation de Glut1 et de Glut4 est stimulée par une ischémie modérée (Young et al., Circulation 1997). L insuline secrétée lors d une élévation de la glycémie accélère l incorporation de glucose par Glut4, et sa phosphorylation par HK. Glut1 Glut4 Hexokinase, HK 6P Glycogène PFK Glycolyse GAPDH Mg 2 PDHa Mitochondrie PD active Cycle De l acide citrique translocation GLUT ischémie Mb MAPK cascade? Glut 1 Glut 4 translocation GLUT Récepteur Kinase (tyrosine) Insuline CIBLES phosphorylation GLUT 4 directe? La résistance sévère à l insuline peut résulter de mutations du gène du récepteur, qui sont associées à la perte de l activité kinase. IRS (Insulin receptor substrate) P85r = PIKINASE (phosphatidylinositol agit comme intermédiaire P110c kinase) Inhibition par pour associer différentes protéines wortmannin & LY de la cascade de signalisation en aval. La "stimulation" de Glut 4 dépend strictement de la PI kinase. PI KINASE PKB/Akt (conformation et/ou réarrangement du cytosquelette?)

4 Les signaux intracellulaires associés à la fixation d insuline sur son récepteur dépendent de l activité de l enzyme PIkinase. Le mécanisme d activation implique la mise en jeu d une molécule intermédiaire, ou «adaptateur», appelée IRS (insulin receptor substrate). Activation de la PI kinase Production de seconds messagers lipidiques : PtdIns(,4,5,P)/ PtdIns(,4,5,P2) Phosphoinositide dependent protein kinase 1(PDK 1) Décodage des signaux lipidiques par un «intégrateur» : la PKB (ou Akt) (PKB est une cible intracellulaire majeure) PKB active [1ère mise en évidence du rôle de PKB dans la signalisation liée à l insuline : Cross et al., Nature 78; , 1995] Phosphorylation par PKB (sur résidus sérine/thréonine) de protéines ines cibles intracellulaires Inhibition de la PFK2 Stimulation glycogène synthase kinase (GSK) du transport Glycolyse de glucose via translocation Glycogène synthase active de GLUT 4 Synthèse de glycogène La stimulation de la synthèse du glycogène met en jeu la phosphorylation, c est à dire l inactivation de la GSK. C est ce qui se passe dans le cœur normal en présence d insuline. Others : proapoptotic Glycogen synthesis Glycogen GSK Glut1 Glycolysis 6P Glut4 PFK2 GLUT Insulin IR Phosphorylation Nuclear export of NFAT and GATA4, thus preventing their effects on gene expression. Cell membrane P IRS P PIK PtdInsP PKB/Akt 2 isoformes de GSK, α et β, qui ont des fonctions différentes. C est GSKβ, qui apparaît jouer le rôle majeur dans les myocytes cardiaques. Exerce un rôle régulateur négatif de l hypertrophie cardiaque. La GSK s oppose aux effets de l insuline. Insulinorésistance le contrôle inhibiteur de la GSK est déficient = activité GSK trop élevée. Son contrôle régulateur négatif de l hypertrophie est levé hypertrophie peut se développer. Les inhibiteurs de GSK augmentent les réponses à l insuline dans différents systèmes in vitro. ex: lithium, valproic acid, SB21676, SB415286, indirubin, In vivo? Régulation intracellulaire de l utilisation du glucose Concentrations plasmatiques élevées d acides gras (c est à dire supérieures à 0.8 mm) inhibition de l utilisation du glucose, ainsi que du lactate. L inhibition s exerce au niveau de l enzyme PFK; son activité est diminuée par l élévation du taux de citrate et de l cytosolique, alors qu elle est à l inverse stimulée par la diminution de concentration d (plus précisément par rapport AMP/). Toutefois, l étape majeure de la régulation se situe au niveau du complexe enzymatique pyruvate déshydrogénase (PDH), sur la face de la mb. mitochondriale. En normoxie, la glycolyse anaérobie est couplée à l oxydation du glucose: le pyruvate issu de la glycolyse est décarboxylé par la PDH. Ce complexe enzymatique constitue une plaque tournante au contrôle sophistiqué, dont l activation conduit à l oxydation du glucose, tandis que son inhibition, à l inverse, prévient cette oxydation. Voie des pentoses phosphates et stress oxydatif (ou oxydant) "pentose phosphate pathway" = glutathion réduit PDH inactive kinase PDH active phosphatase CO2 βoxydation Acides gras G6PDH = enzyme dont l activité est régulée par le rapport NADPH/NADP. La production de NADPH lors de la conversion de G6P catalysée par la G6PDH, maintient le glutathion dans son état réduit c estàdire GSH. Parallèlement, GSH alimente, via l activité de la glutathion peroxydase (GPX), la transformation de peroxyde d hydrogène en H 2 O. H 2 O 2 n est pas une espèce radicalaire mais une espèce activée de O 2 (= ROS: reactive oxygen species), et nombre de données expérimentales récentes ont montré que H 2 O 2, à faibles [ ] physiopathologiques (allant de nano à µmolaires), joue un rôle important dans la signalisation intracellulaire ( prolonged signaling effects ) 4

5 ONOO Peroxynitrite très instable NO O 2 O 2 H 2 O 2 2H 2 O O 2 prolonged signaling effects anion superoxyde SOD Superoxyde dismutase catalase H 2 O 2 H 2 O GPX Glutathion peroxydase GPX knockout (GPX /) mice are susceptible to acute oxidative damage. Conversely, overexpression of GPX renders mice resistant Régulation de l utilisation des acides gras "libres" (AGNE) ou free fatty acids (= non estérifiés) Mb Transport membranaire des AGs (ac. oléique, palmitique, ) fait intervenir une translocase FAT/CD6. "Defect in human LCFA uptake is caused by FAT/CD6 mutations." J Lipid Res Dans le cytoplasme, de petites protéines de liaison, ou FABPs (pour Fatty Acids Binding Proteins) assurent le «trafic» intracellulaire des AGs (Schaap et al. Circ Res 1999). NB Les moyennes et courtes chaînes d acides gras (C2 à C12) ne représentent qu une fraction infime des AG normalement oxydés par le myocarde. acyl CoA synthétases ACC Acyl CoAà longue chaîne CO2 CPT1 PDHa CAT HFABP FAT/CD6 à LC CoA CPT2 Acyl CoA AG(NE) AG translocase extracellulaire Triglycérides intracellulaire mitochondriale Matrice mitochondriale inhibe l activité CPT 1via une interaction allostérique. Autre acteur : l AMPK (AMPactivated protein kinase). "L AMPK is an energy sensor in tissues, and specifically in heart." Quand la charge énergétique de la cellule diminue ( /AMP et PCr/Cr), l AMPK est activée. AMPK phosphoryle et inactive des enzymesclés, en particulier inactive l acl acétyl CoA carboxylase (ACC) entrée des AG dans la mitochondrie n est plus freinée. AMPK CO2 ACC Le malonyl CoA est un inhibiteur physiologique de l utilisation des acides gras via l inhibition de l enzyme CPT1. Acyl CoA CPT1 CPT 1catalyse une étape importante de l oxydation mitochondriale des AGs. L isoforme majeure dans le cœur adulte est le type musculaire M CPT1. Cytosol Mb. mitochondriale Matrice Glycolyse Dans le cœur normoxique, l insuline diminue l activité AMPK (qui est sensible à la wortmannine) CO2 AMPK CAT ACC PIK L activation de l AMPK par l ischémie est aussi inhibée par l insuline. Acyl CoA Cytosol CPT1 X Mb. mitochondriale Acyl CoA Matrice PDHa βoxydation Par conséquent, l insuline inhibe l oxydation des acides gras et stimule l oxydation du glucose. 5

6 Le catabolisme des AGs est aussi finement régulé au niveau de la transcription des gènes. L expression cardiaque de la plupart des gènes impliqués dans l oxydation des AGs après la naissance. Des changements aussi bien chroniques que aigus (ex: jeûne, diabète) influencent l expression de gènesclés. L expression de la plupart des gènes associés au transport et à l oxydation des AGs est régulée par le complexe de régulation transcriptionnelle PPARα (pour peroxisomeproliferator activated receptor α). PPARα a été le 1er membre identifié de la famille de récepteurs hormonaux nucléaires. Potentiellement, les ligands endogènes de PPARα dans les myocytes cardiaques sont les AGs à longue chaîne et leurs métabolites. Il a été montré in vitro que les AGs saturés et polyinsaturés lient et activent PPARα. Une fois engagé avec le ligand, PPAR recrute des coactivateurs transcriptionnels (en particulier PGC1) nécessaires pour initier la transcription du gènecible. Brian N. Finck & Daniel P. Kelly "PPARα signaling in the gene regulatory control of energy metabolism" J Mol Cell Cardiol 4, (2002) Régulation de l utilisation des acides gras "libres" (AGNE) ou free fatty acids (= non estérifiés) Protéines et enzymes connues pour être régulées par PPARα. Cycle TCA Mb AG(NE) AGL acyl CoA synthétases ACC Acyl CoA CO2 CPT1 acétyl CoA cétoacyl CoA thiolase cétoacyl CoA hydroxyacyl CoA déshydrogénase F CPT2 acyl CoA hydroxyacyl CoA translocase Triglycérides acylcoa déshydrogénase énoyl CoA énoyl hydratase extracellulaire intracellulaire mitochondriale β oxydation Matrice d utilisation des acides gras par les cardiomyocytes Mécanismes pouvant associer perturbations métaboliques et dysfonction ventriculaire? Délétère, en particulier si l entrée d AG, excède la capacité oxydative des cellules. 6

7 (1) Consommation d oxygène du myocarde Substrat Rdt global en formé/ Atomes d O 2 de l oxydation d une atomes d O 2 consommés par molécule de substrat consommés mol. de substrat Lactate Acide gras (ex. palmitate) Utilisation préférentielle rentielle des acides gras augmentation de consommation d oxygd oxygène du myocarde L accumulation de triglycérides dans les cardiomyocytes (observée sous forme de gouttelettes lipidiques) peut contribuer à la production d acylcoa à longue chaîne. 1 µm Amélioration du «couplage»entre glycolyse et oxydation du glucose baisse de la production de protons issus du métabolisme anaérobie du glucose, et réduction du déséquilibre ionique Sources de formation des protons : Mécanismes de régulation du ph intracellulaire Hydrolyse de l formé au cours de la glycolyse Mg2 MgADP Pi2 H glycolyse Accumulation de CO2 Dégradation de l Transporteurs membranaires La glycolyse découplée de l oxydation du glucose est une source majeure de H dans le myocarde. Chaque molécule de glucose via la glycolyse (seule) 2 H En revanche, 1 molécule de glucose glycolyse oxydation 0H 7

8 F P F V P L L F I L H I NaL Na (2) HCO MCT H Lac mb ext int β i H NHE1 ph i cardiomyocyte Na Na [Ca 2 ]i [Na ]i NCX HCO Cl AE Na Ca 2 ph e K Extracellulaire Intracellulaire NHE1: Relation structurefonction NH Inhibiteurs H Signaux extracellulaires ex: AngII cytosquelette Pr CaM PKII COO Ca 2 MAPK p42/p44 /CaM PKC Le Prigent K, Lagadic Gossmann D, Feuvray D. Modulation by pho and intracellular Ca 2 of Na H exchange Circ. Res. 1997; 80: Karmazyn M et al. The myocardial Na H exchange. Structure, regulation, and its role in heart disease. Circ. Res. 1999; 85: (review). Structure de NHE1 deux domaines fonctionnels Domaine transmembranaire Transport des ions sites de liaison à l amiloride Localisation de NHE1 dans les myocytes cardiaques disques intercalaires à proximité de la connexine 4 et à un moindre degré dans les tubules transverses ventricule ventricule Wakabayashi et coll. J Biol Chem 2000; 275: oreillette oreillette Domaine ERK cytoplasmique: PIP2 CHP CaM p90 RSK NIK Sites de liaison et d interaction des domaine de phosphorylation protéines ERM NIK régulatrices du ROCK domaine Cter PIP2 (phosphatidylinositol 4,5bisphosphate), ERM (ezrine, radixine et moesine), NIK (Nckinteracting kinase), CHP (calcineurin B homologous protein), et CaM (calmoduline), ROCK (Rho Kinase), p90 RSK (ribosomal S6 kinase). 10 µm 10 µm Comparison of NHE1 protein expression in ventricular and atrial myocardium. A: immunofluorescence image of ventricular tissue incubated in presence of antinhe1 antibody. B: highmagnification image of A. C: immunofluorescence image of atrial tissue incubated in presence of antinhe1 antibody. D: highmagnification image of C. Petrecca et coll., Am J Physiol; µm Colocalization of NHE1 and connexin 4 protein expression in ventricular myocardium. NHE1 protein expression is visible as red labeling; connexin 4 protein expression is visible as green labeling. 10 µm. 8

9 Protéine Méthodologie Extracellulaire site de fixation du DIDS CED 1401 convertisseur IV moniteur lampe Xénon Méthode du "pulse" à l ammonium 7.6 NH 4 Cl ph i Intracellulaire site consensus pour PKA tubes photomultiplicateurs (590 et 640 nm) diaphragme Microscope filtre d interférence (540 nm) hh H 2 N HOOC site consensus pour PKC Sonde fluorescente: CarboxySNARF1 NH H NH H NH NH 4 4 ALCALINISATION Romero MF et al. Expression cloning and characterization of a renal electrogenic Na /HCO cotransporter. Nature 1997; 87 : Choi I et al. Cloning and characterization of human electrogenic Na /HCO cotransporter isoform (hh) Am. J. Physiol. 1999; 276 : C576 C584. H NH NH H NH 4 NH 4 ACIDIFICATION NHE [H ] i ß i ph i A l heure actuelle il n existe pas d inhibiteur spécifique du transporteur Mise en evidence de l activité du transporteur Na HCO () Microfluorimétrie sur cellule unique (cardiomyocytes isolés) 5 min NH 4 Control ( NHE) 1 µm cariporide () Conditions : enregistrement par microfluorimétrie utilisant la sonde csnarf1 méthode du pulse à l ammonium J H = βt X dphi/dt AngII Na Na (2) HCO AT1 récepteur Raf MEK 1/2 MAPK / Erk 1/2 G H PD98059 U0126 NHE extracellulaire membrane intracellulaire Basal activity requires activation of the ERK pathway of the MAPK cascade. Futhermore, activation of the ERK pathway of the MAPK cascade is involved in stimulation of both NHE and activity by angiotensin II. 9