CLONAGE D UN GÈNE DE MEDUSE BIOCHIMIE DE L ADN

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1 CLONAGE D UN GÈNE DE MEDUSE BIOCHIMIE DE L ADN But de la manipulation Le but de cette manipulation est l introduction d un gène de méduse codant pour une protéine fluorescente dans des bactéries par l intermédiaire d un vecteur (=plasmide dans notre cas précis), ce qui nous permettra de cloner ce gène en prélude à une éventuelle purification de la protéine d intérêt. Introduction La GFD (green fluorescent protein) est une protéine naturellement fluorescente trouvée dans des méduses (Aequorea victoria) vivant au fond de la mer et leur servant à la communication par bioluminescence. Elle a été isolée en 1962 par Shimomura et coll., et son gène a été cloné à partir de 1992 par Prasher et coll. C est une protéine unique de 20kDa pouvant servir de marqueur fluorescent, un puissant moyen d études des protéines dans leur contexte biologique. En couplant une protéine d intérêt par couplage avec une GFP, on peut par exemple suivre sa localisation au sein de la cellule par microscopie de fluorescence. La fluorescence est produite par un réarrangement et l oxydation de la séquence Ser-Tyr-Gly, ce qui provoque la formation d une double liaison et une augmentation de la délocalisation électronique, provoquant l émission de lumière d une longueur d onde différente de celle absorbée (elle absorbe la lumière UV pour émettre une lumière verte). Un intérêt particulier de cette protéine est qu elle peut être modifiée par mutagenèse pour étendre ou réduire la délocalisation électronique, et donc de modifier la couleur de fluorescence. On peut ainsi citer comme analogues à la GFP : BFP (bleu) CFP (azur) YFP (jaune) 1

2 Image 1: Structure de la protéine GFP. Le réarrangement et l oxydation de la séquence Ser-Tyr-Gly est à l origine de la fluorescence. Pour une animation de la structure 3D de la GFP : Partie théorique Dans le domaine de la biologie moléculaire, les chercheurs peuvent être confrontés à un problème de taille : les protéines sur lesquelles ils travaillent sont des molécules très petites à notre échelle et exercent le plus souvent leur fonction dans le contexte de la cellule. Autant dire qu il est illusoire d espérer pouvoir les voir avec un simple microscope. Heureusement pour eux (et malheureusement pour nous, pauvres petits étudiants, qui devons écrire un rapport sur le sujet) il existe une science merveilleuse qu est le génie génétique, permettant de produire une protéine 2

3 en très grande quantité afin de mieux pouvoir l étudier et la détecter, et pouvant même permettre la localisation de la petite protéine dans l immensité de la cellule (et il ne reste plus qu au chercheur à être capable de différencier la membrane du réticulum endoplasmique de celle d un lysosome qui passait par là, mais c est un autre problème). Redevenons sérieux. Aujourd hui les chercheurs disposent d outils puissants pour cloner un gène en particulier et induire sa transcription en ARNm puis sa traduction en protéine, incluant des moyen de localisation spatiale de la dite protéine et de quantification. Les premiers de ces outils sont les enzymes de restriction (aussi appelées endonucléases de restriction), qui reconnaissent des séquences de bases spécifiques dans l ADN en double hélice et clivent les deux brins du duplex en des points particuliers, tels des scalpels extraordinairement précis. Ces enzymes sont utilisées dans de nombreux domaines, tels l analyse de la structure des chromosomes, le séquençage de très longues molécules d ADN ou l isolement de gènes particuliers. Le chercheur suisse Arber a reçu un prix Nobel en 1978 pour ces découvertes. Les enzymes de restriction existent naturellement chez de nombreux procaryotes où leur rôle est de cliver des molécules d ADN étrangères, l ADN de la cellule n étant pas dégradé car ne possédant pas la séquence particulière reconnue par l enzyme. Cette séquence, spécifique à chaque enzyme de restriction, est dite palindromique : elle peut se lire de façon identique de droite à gauche ou de gauche à droite, et la coupure de la séquence peut se faire de deux manières : à bout franc (l enzyme coupe exactement au même endroit sur les deux brins) ou cohésive (l enzyme coupe en zigzag, ce qui laisse des extrémités monocaténaires). Les enzymes de restrictions sont utilisées pour couper les molécules d ADN en fragments spécifiques au niveau de leur site de restriction, la séquence qu elles reconnaissent. De tels sites de restriction peuvent être introduits de part et d autre d un gène d intérêt afin de mieux pouvoir manipuler celui-ci. Isoler un gène, c est bien beau, mais encore faut-il ensuite trouver un moyen de l introduire dans une cellule pour que celle-ci puisse le transcrire. On utilise pour ce faire un vecteur de clonage, qui doit être capable d une réplication autonome dans une cellule hôte donnée (qui doit donc posséder son propre origine de réplication) et qui doit supporter l insertion d un fragment d ADN plus ou moins grand. Il existe plusieurs sortes de vecteurs de clonages qui se différencient par leur conditions d utilisation et la taille du fragment d ADN qu ils permettent de cloner : les plasmides, les phages lambda, les cosmides, les phages P1, les BAC (bacterial artificial chromosom) et les YAC (yeast artificial chromosom). Les plasmides permettent de cloner un fragment d ADN jusqu à 20kb. Il s agit de molécules d ADN de petites tailles et circulaires, d origine bactérienne, pouvant être considérée comme un mini chromosome capable de réplication autonome. 3

4 Ainsi, un plasmide contient un ou plusieurs gènes de résistances à des antibiotiques (permettant la sélection des cellules l ayant intégré), une origine de réplication et des sites de restriction permettant le clivage de son ADN circulaire suivit de l insertion d un nouveau gène d intérêt. Avec un plasmide, on peut donc transformer une bactérie (typiquement Escherichia coli) pour qu elle exprime le gène d intérêt. Il suffit pour cela d intégrer le gène en question dans un plasmide par ouverture avec des enzymes de restriction puis fermeture avec des enzymes de ligation, tel un puzzle à l échelle moléculaire, puis d intégrer le plasmide dans la bactérie, qui ainsi exprimera les gènes présents dans le plasmide, à commencer par la résistances aux antibiotiques. Arrivé à un tel stade, il convient de vérifier que le gène d intérêt est bien présent dans la bactérie. Sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide n est pas difficile, il suffit de les faire pousser sur un milieu contenant le ou les antibiotiques contre lesquels les plasmides sont censés les protéger. Par contre, vérifier la présence du gène d intérêt ne peut se faire que par migration sur gel d électrophorèse à la suite d une PCR. La PCR (polymerase chain reaction) est une technique de réplication élective in vitro d ADN double brin, par extension itérative de deux amorces appropriées, sous l effet de l alternance de températures variables : 94 C pour la séparation (dénaturation) des brins matrices, C pour l appariement des amorces, et 72 C pour l action de la Taq polymérase (polymérase thermostable provenant d une bactérie thermophile, Thermus aquaticus). La répétition des cycles assure une duplication exponentielle de chaque brin (le cycle dénaturation/appariement/synthèse étant répété de 20 à 40 fois, ce qui correspond à une amplification de 2 20 à 2 40 ). Par un choix approprié des amorces, on peut n amplifier qu une portion bien définie de l ADN. Les produits d une PCR peuvent être analysés sur gel d agarose, clonés ou séquencés. La PCR est une technique puissante pour le diagnostic médical, la médecine légale et l évolution moléculaire, puisqu elle permet de détecter, par exemple, le virus du HIV-1 chez des sujets qui n ont pas encore eu de réponse immune à ce pathogène et chez lesquels le diagnostic par dosage d anticorps n aurait donc pas pu être réalisé. La bactérie a donc intégré le plasmide contenant notre gène d intérêt, dont la présence a été vérifiée par PCR et analyse sur gel d agarose, et il ne reste plus qu à inciter la colonie ainsi sélectionnée (contenant des clones identiques à la bactérie d origine) à produire en masse la protéine correspondante. Pour cela, on utilise un promoteur particulier en amont du gène d intérêt qui s active lorsqu il reçoit un signal particulier, IPTG dans notre cas. La bactérie se voit donc contrainte de transcrire et traduire encore et encore le même gène, se remplissant de la protéine de méduse fluorescente, dont la présence peut être aisément détectée, justement, par la fluorescence verte qu elle émet sous une lumière UV. 4

5 Et pour récupérer la protéine en question, il suffit de détruire les bactéries par ajout de produit la détruisant (TRIS, NaCl, lysosomes ) et d ajouter des billes de verres dans le lysat ainsi obtenu. Le gène de la protéine d intérêt ayant été associé à un court gène GST dont la protéine correspondante a la particularité de se fixer sur les billes de verres, il ne nous reste plus qu à décoller GST-venus des billes de verres pour obtenir notre protéine purifiée, fluorescente. Merci les méduses. Partie pratique I) Digestion du vecteur et de l insert L insert (le gène GST-venus avec son promoteur IPTG et deux sites de restriction spécifiques aux enzymes utilisées) et le plasmide (PGex4T-3 contenant le gène de résistance à l ampicilline en plus des deux sites de restrictions spécifiques aux enzymes utilisées) sont digérés séparément par les enzymes de restriction BamHI et XhoI, en présence d un tampon spécifique, de BSA (rendant la viscosité optimale pour le bon fonctionnement des enzymes) et H 2 O. On fait migrer les deux solutions sur un gel d agarose 1% afin de vérifier si l ADN est présent, c'est-à-dire qu il n y ait pas d erreur de manipulation. Puis les deux réactions sont incubées à 37 C toute la nuit. Image 2 : dessins de l insert et du plasmide avec les SR II) Purification de l ADN Les deux réactions sont purifiées par différents lavages avec du tampon PB, qui fixe l ADN, puis de la solution de lavage pour éliminer les enzymes restantes et enfin H 2 O. Ces trois manipulations sont séparées par des centrifugations. Cette étape de purification de l ADN est indispensable afin d éliminer les enzymes de restriction qui seraient capables, sinon, d attaquer encore d autres séquences. Après la purification, on procède à la ligation afin de réunir le plasmide et l insert. Deux tubes sont remplis avec le plasmide, le tampon de ligation et la ligase (enzyme de ligation). Un des deux tubes contient également l insert (ligation n 2) tandis que l autre tube sert de contrôle et l insert est remplacé par de l eau (ligation n 1). Les ligations sont incubées à 16 C toute la nuit. Image 3 : dessins du plasmide plus l insert III) Transformation de la bactérie Les bactéries sont tout d abord traitées avec du CaCl 2 ainsi qu avec diverses centrifugations, sous conservation dans la glace afin de les rendre 5

6 compétentes, c est-à-dire aptes à recevoir l insert par la formation de pores dans leurs membranes. Après ce traitement, trois tubes sont préparés : 1. contenant la ligation n 1 (c est-à-dire le plasmide seul, sans l insert) et les bactéries compétentes 2. contenant la ligation n 2 (c est-à-dire le plasmide et l insert) et les bactéries compétentes 3. ne contenant que des bactéries compétentes. Ces trois tubes sont conservés 30 min dans la glace ce qui incite le rapprochement des plasmides sur les membranes des bactéries, puis on provoque un choc thermique à 42 C (pendant 30s à 1min) ce qui, par effet de succion, fait rentrer les plasmides à l intérieur des bactéries par les pores (la hausse soudaine de température les fait gonfler). Les solutions sont ensuite incubées pendant 30min à 37 C en milieu LB, ce qui leur laisse le temps de commencer à exprimer les gènes contenus sur les plasmides, entre autre la résistance à l ampicilline. Puis on étale chaque solution dans une boîte de pétri en milieu de croissance LB et ampicilline. Image 4 : transfo de la bactérie IV) PCR Six tubes sont préparés pour la PCR afin d amplifier l ADN récolté dans nos bactéries. Les tubes contiennent deux primers (= amorces d environ 20 bases s appariant à l extrémité 3 d un brin d ADN simple brin), du tampon, les bases nucléiques dntp (= les bases ATGC) en quantité suffisante, la Taq polymerase (enzyme spécifique à la PCR car résistant à la chaleur de la réaction) et H 2 O. Cinq de ces tubes contiennent également une colonie choisie parmi nos 28 colonies de la ligation n 2 et le dernier tube contient une colonie choisie parmi nos 106 colonies de la ligation n 1 (les colonies choisies étant notées sur les boîte, afin de pouvoir retrouver celles qui nous intéresserons). Les 6 tubes subissent la PCR puis, après l amplification de l ADN, on teste la présence de l insert par migration sur un gel d électrophorèse. 2 clones positifs (c'est-à-dire, possédant l insert) et le clone négatif (dans le 6 ième tube) sont étalés sur des boîtes de pétri neuves et on les laisse se développer pendant le week-end à 37 C. V) Induction Nos deux clones positifs et le clone négatifs sont récoltés dans des tubes différents et mis en présence d IPTG, ce qui provoque l induction de l insert et aboutit à une surproduction de la protéine correspondante. La protéine fluorescente est détectée par UV après une incubation à 37 C pendant 2h. 6

7 Résultats I) Digestion du vecteur et de l insert, puis migration sur gel d agarose : Image 5 : Scan du gel Nous sommes bien en présence d ADN. II) Purification de l ADN Après étalement des bactéries sur les boîtes de pétri et propagation de cellesci en colonies les résultats sont : Boîte n 1 : x colonies Boîte n 2 : y colonies Boîte n 3 : pas de colonies Le résultat pour la boîte n 3 est conforme à celui attendu puisque nous n avons pas étalé de bactérie, aucune colonie ne s est formée. La boîte n 2 contient plus de colonies que la boîte n 1 et ceci peut avoir plusieurs explications : Tout d abord les colonies traduisent le fait que les plasmides fonctionnent et qu ils sont donc refermés. Mais les plasmides peuvent fonctionner même en l absence d insert, pour autant que les sites de restrictions aient été digérés par le même enzyme : (dessins) Après introduction de la ligase, le plasmide se referme sans insert et est donc le même qu au départ. Le nombre assez élevé de colonies sur la boîte n 2 est peut-être du au fait que les sites de restriction de nos plasmides ont été digérés par le même enzyme. Ceci est la conséquence d une mauvaise manipulation dans l étape n 1. Un enzyme n a pas été introduit correctement (avec le bon volume, du à un problème de pipette), et était donc sous exprimé. Le rapport des enzymes n étaient plus de 1 et les sites de restriction des plasmides n ont pas été digérés (ou très peu) par l enzyme sous exprimé. IV) PCR Les six tubes sont étalés sur un gel d agarose 1% pour une migration afin de vérifier si nos colonies de bactéries choisies contiennent les inserts. Les résultats sont négatifs il n y a pas de bactérie contenant l insert. Les plasmides n ont pas d insert et n expriment pas le gène. Ceci est la conséquence du fait qu un enzyme était sous exprimé par rapport à l autre. Les plasmides n ont pas pu intégrer d insert. Image 6 : scan du deuxième gel V) Induction Les résultats de la PCR étant négatifs, les assistants nous fournissent euxmêmes un clone positif afin que nous puissions finir l expérience. 7

8 Induction du gène puis tubes passés sous UV. On ne voit pas la fluorescence (ou alors si faiblement qu on a l impression de l imaginer Ceci est du au fait que bactéries ne sont pas lysées et leur membrane fait barrière, ou parce que l inducteur n a pas très bien fonctionné, ou encore parce qu il y a une mutation dans l insert de départ Conclusion En conclusion on peut dire que l expérience n a pas abouti au résultat prévu puisque l étape de la PCR nous a donné des résultats négatifs. Plusieurs explications sont à retenir, notamment un problème de pipettes qui aurait pu fausser les volumes de solutions et donc altérer les rapports prévu dans les tubes pour les réactions. Le mauvais choix des colonies est peut-être aussi une explication. Ayant un grand nombre de colonies sur la boîte n 2 nous avons pu choisir celles contenant des plasmides sans insert au détriment de celles en possédant (c.f résultat PCR) pour autant qu il y en ait eu.. Cependant cette expérience nous a permis de bien comprendre les manipulations biochimiques de l ADN c est-à-dire les étapes de modification et clonage de gènes pour une insertion dans une bactérie et une expression du gène inséré. Et même si ça n a pas marché, on s est bien marré, merci XD Bibliographie Stryer Mes cours de bioch2 Aide-mémoire de biochimie et de biologie moléculaire, 2 ième édition, Wildmer et Beffa, Editions TEC & DOC Source de l image 1 : (+ ChemDraw) 8