Licence de Biologie Cellulaire L3

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1 Faculté des sciences de Luminy Année Licence de Biologie Cellulaire L3 Module: Le cycle cellulaire et sa régulation Cours: L apoptose Nicolas Bertrand UMR S910 Génétique médicale et génomique fonctionnelle Faculté de Médecine nbertran@univmed.fr

2 PLAN INTRODUCTION - Définitions - Apoptose et nécrose - Généralités sur les rôles de l apoptose - Identification des gènes contrôlant l apoptose DEVELOPPEMENT I. Les caspases II. Les voies d activation des caspases et la régulation de ces voies III. Relations entre prolifération et apoptose EPILOGUE - Pathologie - Techniques d analyse

3 PLAN I. Les caspases 1. Les caspases sont nécessaires et suffisantes pour induire l apoptose 2. Les caspases sont conservées au cours de l évolution animale 3. Les caspases peuvent être classées en deux familles en s appuyant sur des critères fonctionnels et de structure 4. Les caspases subissent des modifications post-traductionnelles activatrices de type clivage protéolytique 5. Les pro-caspases présentent une activité protéasique résiduelle variable 6. Activation post-traductionnelle des caspases 8, 9 7. Autres niveaux de régulation des caspases 8. Les substrats cellulaires des caspases

4 PLAN II. Les voies d activation des caspases et la régulation de ces voies 1. La voie extrinsèque: engagement des récepteurs de mort (vertébrés) a. Structure des récepteurs de mort b. Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de CD95 c. Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de TNFR1, DR3 d. Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de DR4, DR5 et DR6 e. Des récepteurs tronqués et une protéine «caspase-like» régulent la voie extrinsèque 2. La voie intrinsèque: engagement de la mitochondrie a. Rôle des facteurs pro-apoptotiques libérés par la mitochondrie b. Les protéines de la famille Bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe 3. La voie intrinsèque: engagement du réticulum endoplasmique (RE) a. La caspase 12 peut intervenir en aval du RE b. La mitochondrie peut intervenir en aval du RE c. Synergie entre le RE et la mitochondrie 4. Interactions entre les voies extrinsèque et intrinsèque 5. Activation des protéines BH3 par les signaux pro-apoptotiques 6. Rôle de p53 dans l apoptose 7. Régulation de l apoptose dépendante de p53 8. La famille p53 9. Activation des BH3 et de l apoptose indépendamment de p Les IAPs (inhibitors of apoptosis) 11. La voie PI3K/Akt 12. Les points de contrôle des protéines Bcl2 et IAPs

5 PLAN III. Relations entre prolifération et apoptose 1. La voie ARF-MDM2-p53 2. La famille Myc: oncogènes et cibles de multiples voies de signalisation 3. Induction de l apoptose par Myc PATHOLOGIE 1. Intérêt de la voie intrinsèque dans le traitement des cancers 2. Intérêt de la voie extrinsèque dans le traitement des cancers 3. Intérêt des IAPs dans le traitement des cancers Techniques d analyse 1. Essai TUNEL colorimétrique 2. Essai TUNEL fluorescent 3. Anticorps dirigés contre les caspases activées 4. Quantification de l activité des caspases dans des lysats cellulaires.

6 DEFINITIONS La mort cellulaire programmée (terme introduit en 1964 par Lockshin et al) désigne une mort cellulaire physiologique impliquant un processus actif et sous le contrôle d un programme codé génétiquement par la cellule elle-même. L apoptose est un cas de mort cellulaire programmée (MCP) suivant une séquence d évènements cellulaires, cytologiques, bien précis, décrits en 1972 par Kerr, Wyllie et Currie (tissus humains et de rongeurs). Elle concerne les animaux et constitue le cas le plus étudié de mort cellulaire programmée. Apoptose vient d un terme grec qui désigne la chute des feuilles d un arbre ou des pétales d une fleur. Les autres formes de mort cellulaire sont, par exemple, la mort cellulaire indépendante des caspases, la mort par catastrophe mitotique et la mort par autophagie. Il existe des cas de mort cellulaire programmée chez les végétaux (au cours du développement ou en réponse à des pathogènes) mais les évènements cellulaires et cytologiques associés ne sont pas comparables à ceux mis en jeu dans l apoptose. D autre part, il ne semble pas que les programmes génétiques impliqués soient conservés. Des indices suggèrent l existence de la MCP chez les unicellulaires eucaryotes, chez les eubactéries et les archées: le débat reste ouvert sur ce point. La mort cellulaire programmée s oppose à la nécrose, qui constitue un cas de mort «accidentelle». La nécrose est un processus dégénératif qui intervient dans des cellules ayant subi des dommages physiques, chimiques ou osmotiques. Le mécanisme biochimique est mal connu. Les évènements cellulaires et cytologiques sont, bien sûr, différents de ceux rencontrés dans l apoptose.

7 DEFINITIONS Programmed or CICD Certains auteurs considèrent cette forme de MCP comme non apoptotique

8 DEFINITIONS

9 Description cytologique de l apoptose APOPTOSE et NECROSE L apoptose a été décrite grâce à des observations en microscopie électronique à transmission. Elle se déroule en deux phases: 1. formation des corps apoptotiques 2. phagocytose de ces corps La formation des corps apoptotiques est précedée de plusieurs évènements: -La cellule se détache de ses voisines -La chromatine se condense, s accole à l enveloppe nucléaire, se fragmente -Le noyau et le cytoplasme se condense -Les organites s agglomèrent -Le noyau se fragmentent Ceci aboutit à la formation de protubérances à la surface des cellules qui lorsqu elles se détachent donnent les corps apoptotiques. Ces corps sont donc de composition très différente. Les modifications de la chromatine sont le résultat d une fragmentation internucléosomique réalisée par une DNAse.

10 Différences apoptose/nécrose APOPTOSE et NECROSE nécrose apoptose -concerne des groupes de cellules voisines -pas d activité endonucléasique observée -dilatation de certains organites et compartiments -dilatation cytoplasmique -rupture des membranes -réaction inflammatoire -intervient dans des cellules isolées -activité endonucléasique -les organelles restent en général intacts -condensation nucléaire et cytoplasmique -formation de corps apoptotiques -pas de réaction inflammatoire

11 Généralités sur les rôles de la MCP Longtemps, la mort cellulaire a été considérée comme le résultat d une situation pathologique même si dès le 19ième siècle certains scientifiques avaient déjà observé que la mort cellulaire était une constante au cours du développement. Il faut attendre la seconde moitié du 20ième siècle pour que l idée selon laquelle la mort cellulaire, notamment la mort cellulaire programmée comme l apoptose, peut être, dans certains cas, la réponse d une situation non pathologique s impose et devienne un sujet d intérêt. Ainsi la MCP est impliquée dans: -Le développement embryonnaire, post-embryonnaire et post-natal (exemples: cas de la formation des doigts par destruction des tissus interdigitaux, développement du système nerveux au cours duquel on estime que 50% des neurones meurent par apoptose, métamorphose) -Le développement du système immunitaire (exemple: constitution du répertoire T par sélection clonale dans le thymus) -La réponse immunitaire (exemples: élimination de cellules infectées, élimination en fin de réponse d un certain nombre de cellules de l immunité ayant participé à cette réponse, élimination de cellules malignes) -Renouvellement tissulaire (exemple: épithélium intestinal)

12 Caenorhabditis elegans (nématode) Identification des gènes contrôlant l apoptose

13 Identification des gènes contrôlant l apoptose Ced-9::Bcl-2 Ced-4::Apaf-1 Ced-3::protéase à cystéine active

14 Identification des gènes contrôlant l apoptose

15 Identification des gènes contrôlant l apoptose Prix Nobel de Physiologie ou de Médecine 2002 pour leur travaux sur l organogenèse et la mort cellulaire programmée Sydney Brenner (britannique) H. Robert Horvitz (américain) John E. Sulston (britannique)

16 CASPASES Les caspases sont nécessaires et suffisantes pour induire l apoptose Mise en évidence du rôle des caspases en 1993 par la découverte de l homologie entre ced-3 et l enzyme ICE (interleukin-1β processing enzyme) renommée depuis caspase-1 et par la démonstration que la surexpression de la caspase-1 dans des cellules de mammifères est suffisante pour induire l apoptose. surexpression de caspases Inhibiteur de caspases apoptose Signaux inducteurs de l apoptose caspases apoptose

17 CASPASES Les caspases sont conservées au cours de l évolution animale Homme souris drosophile c.elegans 11 caspases 1-10 ; caspases 1-3 ; 6-12 ; 14 7 caspases 4 caspases Les caspases sont des protéases Elles sont synthétisées sous forme de zymogène (pro-caspases) dont l activité est nulle pour certains mais variation selon les caspases (voir plus loin). Elles clivent les protéines après un résidu aspartate (Asp; D). A quelques exceptions près, ce sont les seules protéases de mammifères à posséder cette spécificité de coupure. Elles possèdent une triade catalytique formée, entre autre, par une cystéine active. prodomaine Grande ss-u Petite ss-u (p20) (p10) : Cystéine active

18 CASPASES Les caspases peuvent être classées en deux familles en s appuyant sur des critères fonctionnels et de structure Signaux inducteurs de l apoptose Caspases initiatrices Caspases initiatrices Casp-1 Casp-2 Casp-5 Casp-8 Casp-9 Casp-10 Casp-11 Casp-12 Caspases effectrices Casp-3 Casp-6 Casp-7 Caspases effectrices p20 p10 Caspases initiatrices prodomaine Grande ss-u Petite ss-u apoptose DED: Death Effector Domain Casp-8, 10 CARD: caspase activation Casp-9, 12 and recruitment domain Caspases effectrices prodomaine Grande ss-u Petite ss-u

19 CASPASES Les caspases peuvent être classées en deux familles en s appuyant sur des critères fonctionnels et de structure

20 CASPASES Les caspases subissent des modifications post-traductionnelles activatrices de type clivage protéolytique lorsque les voies apoptotiques sont activées prodomaine Grande ss-u Petite ss-u Signaux inducteurs de l apoptose 1, 2, 3: clivages du zymogène lors de l activation : Cystéine active Caspases initiatrices (autoclivage) autoactivation Caspases effectrices (clivage par les caspases initiatrices) transactivation apoptose Homodimère Caspase-3: forme active

21 CASPASES Les caspases subissent des modifications post-traductionnelles activatrices de type clivage protéolytique lorsque les voies apoptotiques sont activées

22 CASPASES Les pro-caspases présentent une activité protéasique résiduelle variable Par exemple, les pro-caspases 8 et 9 présentent une activité non négligeable alors que la pro-caspase 3 est inactive. (question: comment cette activité est-elle réprimée dans la cellule?) Cette différence proviendrait de séquences présentes uniquement dans les pro-caspases 3 et 7 conférant une très bonne stabilité à la conformation inactive du zymogène. Activation post-traductionnelle de la caspase-7 Pro-caspase 7 inactive homodimère Caspases initiatrices Caspase-7 active homodimère Grande ss-u Grande ss-u Petite ss-u Petite ss-u Grande ss-u Petite ss-u transactivation Petite ss-u Grande ss-u

23 CASPASES Activation post-traductionnelle des caspases-8, 9 La pro-caspase 9 se trouve en majorité sous forme monomérique dans le cytoplasme. Elle est activée par un mécanisme d autoactivation par association avec un régulateur. Le changement de conformation permettant l activation se produit lors de la multimérisation, celle-ci étant stimulée par la liaison de la pro-caspase aux facteurs Apaf- 1 et au cytochrome c. Grande ss-u Petite ss-u Apaf-1 Cytochrome c Activation par régulation allostérique Apoptosome [caspase-9/apaf-1/cyto c]x7 Stoechiométrie floue L activation de la caspase-8 procèderait d un mécanisme d autoactivation par proximité induite. La liaison à des protéines adaptatrices (voir plus loin) entraîne la multimérisation et un changement de conformation qui constituerait une première étape d activation. Puis, le clivage permettrait alors d obtenir une forme pleinement active.

24 Autres niveaux de régulation des caspases CASPASES Bien que les caspases soient exprimées de façon constitutive par de multiples types cellulaires et que les processus d activation post-traductionnels sont de loin les plus importants, d autres mécanismes de régulation ont été identifiés. 1. Régulations transcriptionnelles 2. Phosphorylation 3. Dégradation (régulation de la demi-vie des caspases)

25 Les substrats cellulaires des caspases CASPASES Les caspases ne dégradent pas massivement les protéines cellulaires car leur spécificité de coupure est trop étroite. Elles clivent en un ou quelques sites seulement certaines protéines clés impliquées dans la structuration ou le fonctionnement de la cellule. Une centaine de substrats ont été identifiés à ce jour, substrats qui peuvent être classés en 6 catégories: 1. Protéines impliquées dans l apoptose 2. Protéines kinases 3. Protéines de structure et protéines essentielles 4. Protéines impliquées dans des mécanismes de réparation cellulaire 5. Protéines de régulation du cycle cellulaire 6. Protéines impliquées dans des pathologies Il est à noter que les modifications introduites par les caspases (clivage) et leurs conséquences ont un caractère IRREVERSIBLE: notion de POINT DE NON RETOUR (correspond au moment ou l arrêt du stimulus apoptotique ne peut plus arrêter le processus, coïncide avec l activation des caspase effectrices).

26 Les substrats cellulaires des caspases CASPASES 1/ Caspases Bid, Bcl-2, Bcl-xL (voir plus loin) IAPs (inhibitor of apoptosis; voir plus loin) DFF45/ICAD (DNA fragmentation factor 45 kda; son inactivation permet le clivage internucléosomique de la chromatine) 2/ Akt, FAK (kinases impliquées dans des signaux de survie) PAK2 (kinase pro-apoptotique impliquée dans la formation des corps apoptotiques) ROCK1 (membrane blebbing) 3/ gelsoline (entraîne la coupure des microfilaments d actine et contribuerait ainsi à l arrondissement des cellules et à leur détachement de la matrice extracellulaire) kératines, vimentine lamines A, B, C β-caténine, γ-caténine (destruction des interactions cellule-cellule) topoisomérase I et II, RNA pol I

27 Les substrats cellulaires des caspases CASPASES 4/ DNA-dependent protein kinase (DNA-PK; active les mécanismes de réparation de l ADN en cas de cassures double-brin) ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated; active les mécanismes de réparation de l ADN suite à certains dommages) PARP (Poly ADP-Ribose Polymerase; mécanisme de réparation de l ADN) 5/ Wee1 (inhibition de Cdks; augmente la quantité de certains facteurs proapoptotiques) p27 KIP1 (idem) p21 CIP1 (idem) Rb (inhition de E2Fs; augmente le niveau de synthèse des pro-caspases) 6/ certaines caspases clivent, par exemple, l huntingtine et la protéine APP (amyloid precursor protein), protéines impliquées respectivement dans la maladie de Huntington et la maladie d Alzheimer. Ce clivage favorise l apparition des formes pathogènes de ces protéines qui entraînent la mort de certains neurones.

28 Voies d activation des caspases et régulations La voie extrinsèque: engagement des récepteurs de mort (vertébrés) Les récepteurs de mort et leurs ligands sont des protéines transmembranaires. Ils induisent l apoptose suite à leur activation par des ligands spécifiques. L apoptose est donc ici déclenchée par des signaux provenant de l environnement de la cellule. Cette voie est importante, par exemple, dans le cadre de l immunité (développement du système immunitaire mais aussi réponse immunitaire). Les récepteurs de mort connus à ce jour: CD95 (appelé aussi Fas) (LT et différents tissus) TNFR1 (Tumor-Necrosis-Factor Receptor 1 (ubiquitaire) DR3 (Death-receptor 3) DR4 (appelé aussi TRAIL-R1) (divers tissus) DR5 (appelé aussi TRAIL-R2) (divers tissus) DR6 (p75) Les ligands de ces récepteurs appartiennent à la super-famille du TNF: CD95L (ou FasL) lie CD95 (LT activés, cellules NK) TNF et Lympotoxin-α (LT-α) lient TNFR1 (LT, macrophages) Apo3L lie DR3 (divers tissus) TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand; appelé aussi Apo2L) lie DR4 et DR5 (divers tissus) Le ligand de DR6 est inconnu

29 Structure des récepteurs de mort Voies d activation des caspases et régulations CD95 CRD DD CRD CRD DD: Death Domain (80 acides aminés) domaine d interaction protéine-protéine CRD: Cystein-Rich Domain (le nombre de domaines CRD est variable selon les récepteurs)

30 Voies d activation des caspases et régulations Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de CD95 FADD: Fas Associated Death Domain Protéine adaptatrice DED: Death Effector Domain domaine d interaction protéine-protéine DISC DISC: Death Inducing Signalling Complex Interactions homophiliques (3, 6, 7) Rappel: la caspase-8 contient un DED dans son prodomaine

31 Voies d activation des caspases et régulations Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de TNFR1, DR3 TNFR1/DR3 TRADD DISC FADD TRADD: TNFR-Associated Death Domain Caspase-8 Transduction du signal par les récepteurs de mort: cas de DR4,DR5 et DR6 DR4/DR5 DR6 TRADD? FADD TRADD Caspase-8 FADD?

32 Voies d activation des caspases et régulations Des récepteurs tronqués et une protéine «caspase-like» régulent la voie extrinsèque Des récepteurs proches des récepteurs de mort ont été identifiés sur la base d homologies de séquence. Mais, ces récepteurs ne possèdent pas de DD (secrété ou GPI-anchored) ou seulement un DD partiel, ce qui ne permet pas de recruter les protéines adaptatrices et d activer la voie extrinsèque de l apoptose. Cependant, ils peuvent lier les ligands et agissent comme des «dominants négatifs» d où un effet inhibiteur. TRAIL DR4/DR5 DcR1 DcR2 CD95L CD95 DcR3 Une protéine cellulaire, appelée c-flip (FLICE-Like Inhibitory Protein), proche de la procaspase 8 a été identifiée. Elle se présente sous deux isoformes, une forme longue et une forme courte. Ces deux formes n ont pas d activité protéasique. La forme courte contient des DEDs proches de ceux de la pro-caspase 8. La forme longue contient en plus de ces DEDs, un domaine catalytique inactif proche de celui de la pro-caspase 8. FLIP L Caspase-8 FLIP S FLIP R

33 Voies d activation des caspases et régulations La voie intrinsèque: engagement de la mitochondrie Cette voie est encore appelé voie du stress. Elle est activée en réponse à des signaux intracellulaires (dommages à l ADN), des signaux de stress (hypoxie, privation en facteurs sériques et cytokines) ou par la dérégulation de la transduction de signaux contrôlant la prolifération cellulaire (stimuli oncogéniques). L activation de cette voie converge vers la mitochondrie pour entraîner le relargage d un certain nombre de facteurs pro-apoptotiques contenus dans cet organite suite à la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (nous nous limiterons à cet aspect). Dommages ADN Stress Oncogènes MITOCHONDRIE Cytochrome-c Smac/Diablo Htra2/Omi AIF EndoG APOPTOSE «Apoptose» caspase-indépendante

34 Voies d activation des caspases et régulations La voie intrinsèque: rôle des facteurs pro-apoptotiques libérés par la mitochondrie Cas du cytochrome-c: Cyt-c Interaction et Changement de conformation pour Apaf-1 Apaf-1 Recrutement via domaines CARD Interactions homophiliques Caspase-9 (initiatrice) Casp-3, 6, 7 Apaf-1: Apoptosis Protease Activating Factor-1 Cas de Smac/Diablo et Htra2/omi: Smac/Diablo Htra2/Omi Interactions protéine-protéine IAPs (Inhibitors of Apoptosis) Caspases activées

35 Voies d activation des caspases et régulations Les protéines de la famille Bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (Bcl-2: B-Cell/Lymphoma-2) Il existe au moins une vingtaine de protéines dans cette famille. Elles peuvent être classées en trois groupes en tenant compte de leurs caractéristiques structurelles et fonctionnelles. BH: Bcl-2 Homology domain Le domaine trans-membranaire (TM) est important dans le ciblage des protéines Bcl-2 vers les membranes internes. Dans des cellules saines, Bcl-2 est localisé au niveau de l enveloppe nucléaire, du réticulum endoplasmique (RE) et de la membrane externe mitochondriale (Bcl-x L et Bcl-w se localisent dans la membrane externe mitochondriale de façon prépondérante).

36 Voies d activation des caspases et régulations Les protéines de la famille bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe Bax et Bak nécessaires pour l apoptose. Ils pourraient jouer un rôle dans le processus de perméabilisation. Bak est membranaire (mitochondrie et RE). Bax est cytoplasmique. Les protéines BH3-only fonctionnent en amont des protéines Bax comme capteurs des signaux pro-apoptotiques. BH3 BH3 Bcl-2 Bax/Bak

37 Voies d activation des caspases et régulations Les protéines de la famille bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe dérepresseurs activateurs BH3 (noxa ) BH3 (tbid, Bim) Interaction protéine/protéine Bcl-2 Bax/Bak

38 Voies d activation des caspases et régulations Les protéines de la famille bcl-2 contrôle la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe Signal pro-apoptotique BH3 Bax??? membrane externe mitochondriale Bcl-2 Bak Bax Bak Bax oligomérisation Cytochrome-c Changements de conformation de Bax et Bak en réponse aux signaux pro-apoptotiques permettent homo-oligomérisation

39 Voies d activation des caspases et régulations La voie intrinsèque: engagement du réticulum endoplasmique (RE) De nombreuses évidences suggèrent une implication du RE dans l apoptose selon deux modes d action: -Initiation de l apoptose indépendante de la mitochondrie -Sensibilisation de la mitochondrie aux signaux pro-apoptotiques Le RE est le lieu ou les protéines passant par la voie de sécrétion se replient. Lorsque cette fonction est perturbée ou compromise (stress), une réponse est déclenchée pour tenter de la restaurer: UPR (unfolded protein response). UPR 1 2 Réponse de survie Apoptose -Arrêt de la synthèse protéique -Augmentation de l expression des chaperonnes

40 Voies d activation des caspases et régulations La caspase 12 peut intervenir en aval du RE La caspase 12 a été identifiée seulement chez la souris pour le moment. Elle est localisée dans la membrane du RE et des cellules mutantes pour la caspase-12 sont partiellement résistantes à l apoptose induite par le RE. Protéines non repliées Ca 2+ membrane du RE? cytoplasme pro-caspase 12? calpaïne Ca 2+ caspase-12 autres substrats pro-caspase 9 caspase-9 Caspases effectrices Apoptose Le mécanisme proposé ci-dessus implique donc que cette voie est indépendante de la mitochondrie

41 Voies d activation des caspases et régulations La mitochondrie peut intervenir en aval du RE Le lien entre le RE et la mitochondrie ferait intervenir des protéines BH3 (pas le seul mécanisme) Protéines non repliées Ca 2+ membrane du RE cytoplasme Bad? Ca 2+ Bcl-2 Bax/Bak

42 Synergie entre le RE et la mitochondrie Voies d activation des caspases et régulations Les protéines BH3 sont importantes dans l activation des caspases via la mitochondrie en interagissant avec les autres protéines de la famille. Or, les trois types de protéines Bcl-2 sont retrouvés au niveau du RE et sont donc susceptibles de réguler l activation des caspases via ce compartiment. Il est également possible d envisager que des signaux pro-apoptotiques activent les deux voies.

43 Voies d activation des caspases et régulations Interactions entre les voies intrinsèque et extrinsèque Type cellulaire I Voie extrinsèque seule Type cellulaire II Amplification par voie intrinsèque Notion démontrée pour des lignées et certains types cellulaires in vivo mais la réalité physiologique de cette dichotomie n est pas clairement établie

44 Voies d activation des caspases et régulations Interactions entre les voies intrinsèque et extrinsèque Signaux pro-apoptotiques p53 Fas/CD95 DR5 Caspase-8 MITOCHONDRIE Cette action de p53 pourrait déclencher l apoptose ou entraîner une sensibilisation de la cellule dans un contexte riche en ligands pour les récepteurs de mort.

45 Voies d activation des caspases et régulations Activation des protéines BH3 par les signaux pro-apoptotiques 1/ Activation transcriptionnelle -Noxa -Puma Dommages ADN, Hypoxie 2/ Activation post-traductionnelle -Bad Privation en facteurs sériques Sa déphosphorylation permet de le libérer d une protéine qui le séquestre dans le cytoplasme et donc de l envoyer vers la membrane externe mitochondriale ou il interagit avec une protéine du groupe Bcl-2. -Bid Il est clivé par certaines caspases pour être activé, ce qui lui permet d être envoyé vers la membrane externe mitochondriale et d interagir avec une protéine du groupe Bcl-2.

46 Rôle de p53 dans l apoptose Voies d activation des caspases et régulations p53 est une protéine suppresseur de tumeurs; p53 est un facteur de transcription. Dommages ADN Hypoxie Oncogènes p53 Points de contrôle du cycle Arrêt de la prolifération? Sénescence Réparation de l ADN Apoptose?: régulations transcriptionnelles et non transcriptionnelles de gènes impliqués dans l apoptose

47 Rôle de p53 dans l apoptose Voies d activation des caspases et régulations p53 découvert en Depuis 1985, identification d isoformes.

48 Rôle de p53 dans l apoptose Voies d activation des caspases et régulations Régulations transcriptionnelles de gènes de la famille Bcl-2 Bax p53 Noxa (BH3) Puma (BH3) Ces régulations peuvent initier l apoptose Régulations transcriptionnelles de gènes de la machinerie apoptotique p53 Apaf-1 Caspase-6 Ces régulations ne permettent pas, probablement, l initiation de l apoptose mais contribuent à potentialiser la réponse apoptotique dans le contexte d une libération de cytochrome-c

49 Rôle de p53 dans l apoptose Voies d activation des caspases et régulations Régulations transcriptionnelles de gènes qui inhibent les voies anti-apoptotiques RTK p53 PTEN PI3K Akt/PKB L importance de cette régulation Dépend des types cellulaires Survie Régulations transcriptionnelles de gènes codant des IAPs p53 Répression transcriptionnelle Survivine (IAP) Bcl-2

50 Rôle de p53 dans l apoptose Contrôle non transcriptionnel de l apoptose Voies d activation des caspases et régulations Des données récentes tendent à montrer qu en réponse aux signaux pro-apoptotiques, p53 s accumule au niveau de la mitochondrie. Cette accumulation provoque la libération du cytochrome-c et l activation des caspases. L interaction directe de p53 avec divers membres de la famille bcl-2 est à la base de cet effet.

51 Rôle de p53 dans l apoptose Contrôle non transcriptionnel de l apoptose Voies d activation des caspases et régulations

52 Rôle de p53 dans l apoptose Contrôle non transcriptionnel de l apoptose Voies d activation des caspases et régulations

53 Rôle de p53 dans l apoptose Voies d activation des caspases et régulations

54 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 p53 Points de contrôle du cycle Arrêt de la prolifération Sénescence Réparation de l ADN Apoptose Comment s effectue le choix d une réponse Apoptose versus une autre réponse? -dépend du type cellulaire considéré -pourrait dépendre du signal pro-apoptotique ou de son intensité -pourrait dépendre de l état d activation d autres voies ayant un impact sur les voies apoptotiques par exemple (importance du microenvironnement)

55 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Un modèle postule que c est l amplitude et/ou la durée de la «réponse p53» qui sera déterminante dans la destinée de la cellule, c est-à-dire la quantité de forme active de p53 et la durée de vie de cette forme. Quantité de p53 active q2 apoptose p53 p53 p21 Sites de haute affinité.. q1 arrêt prolifération arrêt prolifération p53 Noxa δt1 q1 < q2 δt2 p53 Sites de faible affinité Apaf-1.. (δt1; q1) = f (Intensité signal; durée signal) apoptose (δt2; q2) = f (Intensité signal; durée signal)

56 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Zhao et al. ont utilisé une lignée cellulaire p53-/- dans laquelle ils peuvent contrôler le niveau d expression de p53 produit à partir d un transgène inductible introduit dans ces cellules (appelées EB-1). L induction est réalisée en utilisant des traitements au ZnCl2 à différentes concentrations. Induction de l expression de p53 après 8h de traitement au ZnCl2 50µM: 100µM: 200µM: pas de mort cellulaire les premières 24H Idem mort cellulaire massive les premières 24H Cinétique d expression de groupes de gènes après un traitement au ZnCl2 (100µM) Cluster 2: on retrouve des gènes de réponse à p53 qui contrôlent l arrêt du cycle cellulaire Cluster 3 et 4: on retrouve des gènes de réponse à p53 qui contrôlent l apoptose

57 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Un second modèle intègre le fait que des modifications post-traductionnelles de p53 peuvent modifier l activité transcriptionnelle du facteur. Les modifications les mieux étudiées de p53 sont les phosphorylations. Signal 1 Signal 2 p53 P P P p53 p53 P p21 P P p53 Noxa P p53 P P p53 Apaf arrêt prolifération apoptose

58 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Zhao et al. ont traité plusieurs lignées cellulaires avec différents types de rayonnements entraînant des dommages dans l ADN de différents types et pouvant induire un arrêt du cycle ou l apoptose en fonction des types cellulaires considérés. UV Rayons γ ZnCl2 Lignées 1, 2, 3 et 4 EB-1 Profil 1 Profil 2 Profil 3 Profil: ensemble des gènes induits ou réprimés par p53

59 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53

60 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Dans une cellule saine et non soumises à des signaux de stress ou oncogéniques, la quantité de protéine p53 est faible. Ceci est le résultat d une dégradation active de la protéine. Cette dégradation est induite par l interaction avec la protéine Mdm2 (mouse double minute 2). Mdm2 inhibe également la fonction transactivatrice de p53 (Hdm2 chez l homme). NB: cette régulation semble spécifique des vertébrés.

61 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Un troisième modèle prévoit que l activation de voies de signalisation collatérale ou la présence de cofacteurs peut modifier la «réponse p53». dommages ADN oncogènes Signalisation de survie (Ex: voie PI3K/Akt, cytokines) p53 iaspp p53 ASPP1/2 p53 arrêt prolifération apoptose

62 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53 Les cofacteurs interagissent avec p53 via son domaine de liaison à l ADN Hzf: hematopietic zinc finger PML: promielocytic leukaemia protein

63 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53

64 Voies d activation des caspases et régulations Régulation de l apoptose dépendante de p53

65 La famille p53 Voies d activation des caspases et régulations En 1997, identification de p63 et p73, deux gènes codant des protéines proches de p53. p53 p63/p73 -Pas de rôle dans le développement -Rôle dans l apoptose déclenchée par des signaux de stress -rôle dans le développement -rôles dans l apoptose (indépendants de p53?; en parallèle?; en coopération?)

66 Voies d activation des caspases et régulations Activation des BH3 et de l apoptose indépendamment de p53

67 Les IAPs Voies d activation des caspases et régulations Les premiers IAPs ont été identifiés chez les baculovirus et depuis ont été trouvés chez la drosophile et les vertébrés. Le domaine BIR (Baculoviral IAP Repeat) est un caractère essentiel des IAPs mais n est pas suffisant pour assigner un rôle anti-apoptotique à une protéine. BIR: Baculoviral IAP repeat NAIP: Neuronal apoptosis inhibitory protein c-iap: Cellular IAP XIAP: X-chromosome-linked IAP Ts-IAP: testis-specific IAP

68 Les IAPs Voies d activation des caspases et régulations Les IAPs inhibent l apoptose en ciblant les capases initiatrices et effectrices. Le premier mécanisme d inhibition des caspases implique une interaction protéine-protéine entre l IAP et la caspase via les domaines BIR. Le deuxième mécanisme implique le domaine RING de certains IAPs. BIR BIR IAP caspases cibles NAIP casp 3; 7 casp 3; 7 casp 9 XIAP casp 3; 7; 9 Inhibition compétitive (blocage de l entrée du substrat) RING Blocage de la dimérisation donc du changement de conformation Dégradation de la caspase c-iap1 casp 3; 7; 9 c-iap2 casp 3; 7; 9 Survivin casp 3; 7 Livin casp 3; 7; 9 Ts-IAP casp 9

69 La voie PI3K/Akt Voies d activation des caspases et régulations Identification de Akt en Elle est aussi appelée PKB (Protein Kinase B). Il existe trois gènes chez les mammifères: Akt1, Akt2 et Akt3. A ce jour, il est postulé que ces trois gènes possèdent des fonctions redondantes. Les protéines Akt sont des sérine-thréonine kinases. RTK phosphoinositides PIP2/PIP3 P Akt P PDK1 P PI3K PTEN phosphatases O O H 2 C O C R 2 R 1 C O CH O H 2 C cleavage by Phospholipase C O P O OH PIP H 2 phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate O H OH H H 2 OPO 3 OH H H 2 OPO 3

70 La voie PI3K/Akt Voies d activation des caspases et régulations Akt P P p53 Bad (BH3) GSK3 expression de certains gènes proapoptotiques NF-κB P expression de gènes de survie APOPTOSE Bcl-X L IAPs

71 Voies d activation des caspases et régulations Les points de contrôle des protéines Bcl2 et IAPs Signaux de survie 1 Point de contrôle des protéines Bcl Point de contrôle des protéines IAPs 2

72 Les points de contrôle des protéines Bcl2 et IAPs Voies d activation des caspases et régulations

73 La voie ARF-MDM2-p53 Relations entre prolifération et apoptose La protéine p19 ARF (souris) ou p14 ARF (Homme) (ARF: Alternative Reading Frame) est induite en réponse à des signaux oncogéniques. Elle se lie directement à MDM2 ou HDM2 et inhibe ces dernières par deux mécanismes: -inhibition de l activité d ubiquitinylation de p53 par MDM2/HDM2 -séquestration de MDM2/HDM2 dans le nucléole Oncogènes ARF MDM2 p53

74 La voie ARF-MDM2-p53 Relations entre prolifération et apoptose La régulation de l expression de ARF par E2F constitue un lien entre prolifération et apoptose en reliant la voie Rb à la voie p53.

75 La voie ARF-MDM2-p53 Relations entre prolifération et apoptose Une question qui se pose est de savoir dans quelles conditions l expression de ARF est activée par E2F. ARF n est pas exprimé de façon périodique au cours du cycle lors des phases pendant lesquelles l activité de E2F est présente. L induction de ARF est donc spécifique d un signal prolifératif dérégulé. Gènes phase S E2F p19 ARF X Cinétique d induction de X lente

76 N1 La voie ARF-MDM2-p53 Relations entre prolifération et apoptose Un élément de réponse non classique pour E2F identifié dans le promoteur de ARF EREA: E2F responsive element of ARF promoter

77 Diapositive 76 N1 Nicolas; 13/02/2009

78 La fonction pro-apoptotique de E2F1 Relations entre prolifération et apoptose E2F1 possède un large spectre d action pour sensibiliser les cellules à la mort cellulaire programmée et à l apoptose en particulier et probablement dans certaines conditions également induire la MCP.

79 La fonction pro-apoptotique de E2F1 Relations entre prolifération et apoptose E2F1 et quelques mécanismes qui sous-tendent sa fonction pro-apoptotique. Activation et répression transcriptionnelle mais également interaction protéine/protéine procaspases

80 Relations entre prolifération et apoptose La famille Myc: oncogènes et cible de multiples voies de signalisation Les membres principaux sont c-myc, N-Myc et L-Myc. Ce sont des oncogènes dont l activité est dérégulée dans plusieurs types de cancers par plusieurs mécanismes. Un trait essentiel de cette dérégulation est la sur-expression des protéines Myc. Les protéines Myc sont essentielles à la progression du cycle cellulaire (G1-S; S) et peuvent déclencher une réponse apoptotique. Ce sont des facteurs de transcription. RTK Ras Autres voies Max Myc MAPK Cyclines D Myc Myc E2F Gène de réponse immédiate au sérum

81 Induction de l apoptose par Myc Relations entre prolifération et apoptose Comme pour p53, la quantité de protéines Myc peut être considérée comme déterminante dans la réponse finale de la cellule: prolifération ou apoptose. L activité transactivatrice de Myc et la dimérisation avec Max sont essentielles à l activité pro-apoptotique de la protéine. Activation de la transcription et répression sont probablement impliquées. Action transcriptionnelle puma Myc Action transcriptionnelle ARF p53 Avec des intermédiaires Action transcriptionnelle et post-transcriptionnelle Bcl-2/Bcl-X L

82 Induction de l apoptose par Myc Relations entre prolifération et apoptose Comme dans le cas de E2F, le mécanisme d action de Myc sur l expression de ARF n est pas clair. Il n a pas été montré que Myc se fixe sur le promoteur de Arf. Répresseurs de Arf Myc ARF E2F Régulateurs positifs de Arf

83 PATHOLOGIE L apoptose participe au développement et à l homéostasie. Une dérégulation de ce processus de mort programmée peut conduire au développement de pathologies ou participer à la pathogénicité de certaines maladies. L activation anormale de l apoptose entraîne une dégénérescence des tissus dans les cas d ischémie, de SIDA, des maladies neurodégénératives et de chocs septiques - Maladie d Alzheimer - Maladie de Parkinson - ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) L inactivation de l apoptose peut contribuer à la cancérisation

84 PATHOLOGIE La thérapie, dans le cas de cancers, a pour but de stopper la progression d une tumeur puis de la faire régresser. Une possibilité est de tuer les cellules malignes en stimulant, par exemple, l apoptose et ceux de manière la plus spécifique possible afin de limiter les effets secondaires délétères. Intérêt de la voie intrinsèque dans le traitement des cancers radiothérapie

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88 PATHOLOGIE Ciblage des protéines de la famille Bcl-2 Arguments: la surexpression de Bcl-2 contribue au processus oncogénique dans plusieurs modèles de tumeurs chez la souris, une surexpression expérimentale peut conférer une résistance au chimio- et radiothérapies à des cellules transformées. Avantage: Bcl-2, Bax/Bak et les BH3 agissent en aval de p53. Stratégies à l étude: -Oligonucléotides antisens pour éliminer la fonction Bcl-2. -Utilisation de vecteurs viraux permettant de surexprimer Bax ou des protéines BH3. -Développement de mimétiques du domaine BH3.

89 PATHOLOGIE Intérêt de la voie extrinsèque dans le traitement des cancers Une possibilité est d activer la voie extrinsèque pour éliminer les cellules tumorales en administrant un ligand ou un agoniste de ce ligand au patient. Avantages: accès direct aux caspases par la machinerie des récepteurs de mort ( en théorie limite les résistances), la voie extrinsèque est indépendante de p53 (mutée dans plus de la moitié des tumeurs) Cependant, l utilisation expérimentale de ligands comme TNF ou CD95L/FasL s est révélée peu prometteuse car ces ligands entraînent des effets secondaires létaux (réaction inflammatoire importante tel un choc septique dans le cas de TNF et destruction des hépatocytes dans le cas de FasL). La découverte du ligand TRAIL constitue cependant un espoir car ce ligand et ses récepteurs sont normalement exprimés dans la quasi-totalité des tissus normaux ce qui montre que des mécanismes de protection existent dans les tissus sains (on peut penser au rôle des récepteurs tronqués mais d autres mécanismes existent probablement). Par ailleurs, il a été montré que TRAIL peut entraîner la mort par apoptose de divers types de cellules tumorales (lignées ou culture primaire). Malheureusement, dans beaucoup de neuroblastomes, l expression des caspases 8 et 10 est perdue ce qui constitue une explication de la résistance de ces lignées à l apoptose médiée par TRAIL. D autres raisons pour la résistance à TRAIL: surexpression de FLIP S ou de transducteurs de signaux de survie par exemple. A ce jour, des chimiothérapies associées à TRAIL se sont révélées efficaces dans le traitement de tumeurs p53 +/+. Une des stratégies explorées: réguler positivement l expression de DR5.

90 PATHOLOGIE Intérêt des IAPs dans le traitement des cancers Des données montrent que les IAPs se comportent comme des oncogènes: niveau d expression élevé dans certaines tumeurs et mise en évidence de processus d amplification génique conduisant à une surexpression de certaines de ces protéines. L inhibition de l expression de ces protéines ou de leur activité est donc une stratégie prometteuse dans le traitement de certains cancers. Elle conduirait, par exemple, à sensibiliser les cellules malignes au traitement classiques de chimio- et radio-thérapie. Pour ce faire des oligonucléotides anti-sens sont à l étude in vitro et in vivo. Une association de deux approches a été réalisée sur un modèle de tumeur induite chez les souris nude: elle consiste à co-administrer des peptides Smac avec le ligand TRAIL. Cette approche s est révélée efficace dans le cadre de ce modèle.

91 Techniques d analyse Essai TUNEL colorimétrique (TdT-mediated dutp nick end-labeling) TdT: Terminal-deoxynucleotidyl-Transferase Principe: la TdT permet l ajout de dutp biotinylé aux extrémités 3 OH de l ADN fragmenté des cellules en apoptose. On utilise ensuite de la streptavidine couplée à la peroxydase et on révèle en utilisant un substrat de cette enzyme (DAB [diaminobenzidine], donne un précipité de couleur brune). Ainsi, les noyaux des cellules apoptotiques apparaissent bruns ou noirs après le marquage qui peut être réalisé sur des cultures de cellules ou des sections de tissus.

92 Techniques d analyse Essai TUNEL fluorescent Principe: le dutp est couplé cette fois-ci à la fluorescéine. Le marquage peut être réalisé sur des cellules en culture même si ce sont des cellules non adhérentes et sur des sections de tissus. Ici, on pourra analyser les résultats par la cytométrie de flux également ce qui permet dans certains cas des quantifications plus fines du nombre de cellules apoptotiques.

93 Techniques d analyse Marquage par Annexine V Principe: l annexine V est une protéine capable de reconnaître la phosphatidylsérine présente dans le feuillet externe de la membrane plasmique des cellules apoptotiques. Elle peut donc être couplée à différents fluorochromes et servir d outil pour détecter ces cellules. Des cellules ont été traitées avec un anti-fas, incubées avec de l annexinv-fitc puis passées sur un cytomètre de flux.

94 Techniques d analyse Anticorps dirigés contre les caspases activées anti-caspase 3 activée: anticorps polyclonal développé chez le lapin. Le peptide utilisé pour immuniser le lapin est identique chez l Homme, la souris, le rat et le hamster ce qui lui confère une réactivité croisée importante. Il est particulièrement indiqué pour l immunohistochimie (immuno sur sections de tissus et sur cultures cellulaires adhérentes)

95 Techniques d analyse Quantification de l activité des capases dans des lysats cellulaires Principe: un tétrapeptide, substrat de la caspase-3 et couplé à un fluorochrome, est incubé en présence des lysats cellulaires. Après clivage par la caspase, le produit émet une fluorescence différente du peptide non clivé qui peut être quantifiée au spectrophotomètre. Cette méthode est très sensible. 4H