Journée plate-forme CORSAIRE, Rennes, 22 Novembre 2010 La plate-forme de métabolomique de la Station Biologique de Roscoff

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1 , Rennes, 22 Novembre 2010 La plate-forme de métabolomique de la Station Biologique de Roscoff Sophie Goulitquer

2 Présentation de la Plateforme de Spectrométrie de Masse Service Informatique et génomique, FR2424 Fanny Gaillard Acquis en 2008, avec le soutien financier de l'europôle Mer et de la Région Bretagne Métabolites, sucres, proteines : mesures de masse exacte. Peptide mass mapping, Séquençage de novo, Identification structurale Limite de détection 1 fmol.µl-1, R = ABI Voyager DE STR MALDI TOF Ionisation: MALDI Matrix assisted Laser Desorption Ionization Séparation : TOF Time Of Flight Linear / Reflectron Polymères, sucres, protéines : Mesures de masse exacte, Limite de détection 1 pmol.µl-1, R = 500 Peptide mass mapping, Limite de détection 50 fmol.µl-1, R = Thermo Orbitrap Discovery Ionisation: ESI Electrospray Ionization Séparation : trappe + orbitrap Acquis en 2010, grâce aux Fonds Européen de Développement Régional

3 Moyens dédiés à la Métabolomique GC/MS Agilent 5975C inert Deux modes d'ionisation : - Impact éléctronique (EI) fragmentation => identification - Ionisation chimique (CI) Ion moléculaire => quantif./traces Composés halogénés

4 Sur-expression d une des PKS type III d E. siliculosus Gel SDS-PAGE (Coloration au Bleu Colloïdal). 13 fractions où la protéine est pure MALDI-TOF Cliquez pour modifier le style des sous-titres du masque Mass: m/z Score: 163 Expect: 6e-10 Matches: 32 Polyketide Synthase III [Ectocarpus siliculosus] F. Gaillard Purification sur colonne chargée en Nickel (NiNTA)

5 Synthèse du Phloroglucinol chez Pseudomonas fluorescens Polyketide synthase de type III (PKS)

6 Résultats de la réaction enzymatique en GC/MS Abundance

7 Résultats GC/MS Blanc Lauroyl-CoA PKS + Lauroyl-CoA PKS + Palmitoyl-CoA

8 Résultats GC/MS Blanc Lauroyl-CoA PKS + Lauroyl-CoA PKS + Palmitoyl-CoA

9 Ion extrait m/z 410 Tr = 64,51 min Abundance 3 heures 1 heure 5 heures Contrôle bouilli Time

10 O O CH3 O O Abundance??? OH O O CH3 O O M+ = 410 m/z m/z O H3C Si H3C CH m /z-->

11 La Métabolomique ciblée Les AGPIs Les Oxylipines Les Aldéhydes

12 La Métabolomique sans a priori 1, 2, 3 : Ectocarpus souche d'eau de mer cultivée dans l'eau de mer 4, 5, 6 : Ectocarpus souche d'eau douce cultivée dans l'eau douce 7, 8, 9 : Ectocarpus souche d'eau douce cultivée dans l'eau de mer Adaption de la souche d'eau douce à la culture en eau de mer à Vérifications données papier accepté dans Plant Cell & Environment.

13 Identification des métabolites

14 La SBSE : Stir Bar Sorptive Extraction Fibre de PDMS Aimant - Sorption - Partage entre le PDMS et la matrice Equilibre (ph, NaCl, T ) - Dérivation in-situ Enrobage en verre Désorption: - Ultra-sons dans un solvant, après dérivation - Par désorption thermique (Unity 2) Bouchon en téflon Fiole en verre Eau de mer d incubation Twister 250 tr.min-1 Réactifs 90 C

15 Désorbeur thermique Unity 2 (Markes) Désorption primaire : Désorption du Tube. Fuite Gaz Vecteur (He) Tube de désorption chauffé Débit désorption GC MS Piège -30 C Gaz Vecteur (He) Désorption secondaire : Désorption du Piège. Fuite Tube de désorption refroidi Piège 250 C GC MS Gaz Vecteur (He) DB-624 (60m x 0,25mm x 1,40µm) Agilent

16 Eau de mer issue d'un naissain en croissance normale Eau de mer issue d'un naissain en mortalité

17 Autres modes de collection des volatils : - Super Q - Tenax -...

18 L Orbitrap Masse exacte et analyse MS/MS dans un même run.

19 Chaine HPLC Ultimate 3000 DUAL (Dionex) - Possibilité UPLC (run < 20 min) - SPE on-line - Conditionnement de colonne pendant un run - Deux run en parallèle

20 Autotrace (Dionex) SPE sur de grand volumes d eau de mer 15 ml à 4L 6 échantillons en parallèle 18 échantillons par jour Précellys (Ozyme) Cryobroyeur 24 positions Répétabilité

21 Métabolomique sur un organisme marin ET son environnement Vide Headspace GC/MS Air Adsorbant (Super Q, Tenax,... ) Eau de mer extraction SPE, GC/MS ou LC/MS Algue Cryobroyage, LC/MS

22 UMR 7139, Roscoff Philippe Potin, Laurence Meslet-Cladière, Thierry Tonon FR 2424, Roscoff Fanny Gaillard Pfompi, Ifremer, Plouzané Charlotte Corporeau, Stéphanie Madec