La Robotique a-t-elle un avenir en Microbiolologie?

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Oscar Charbonneau
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1 La Robotique a-t-elle un avenir en Microbiolologie? Stéphane L Haridon Laboratoire de Microbiologie des Environnements Extrêmes, UMR6197 Institut Universitaire Européen de la Mer Université de Bretagne Occidentale - Centre National de la Recherche Scientifique - IFREMER

2 Le Monde Microbien - Les microorganismes constituent un groupe extrêmement diversifié d organismes microscopiques, unicellulaires et répartis dans les trois domaines du vivant ( bactéries, archées et eucaryote). - Les microbes ont dominé la terre pendant plus de 3 milliards d années et sont la source de toutes les autres formes de vie. (les premières bactéries mi-mars, le premier homme le 31 décembre). - Total : cellules procaryotiques (Whitman,1998). - Observation des premières bactéries au microscope en : Robert Koch. Isolement du Bacillus anthracis responsable de la maladie du charbon. Mise au point du milieu solide: isolement de bactéries.

3 Classification des bactéries : Taxonomie - Phénotypique : forme, métabolisme, optimum de croissance, résistance aux antibiotiques, - Classification analytique : nomenclature binomiale Règne : Procaryotes Domaine : Bacteria le phylum : Gracilicutes la classe : Scotobacteria l'ordre : Enterobacteriales la famille : Enterobacteriaceae le genre : Escherichia l'espèce : Escherichia coli - Classification moléculaire :

UNE REVOLUTION MOLECULAIRE - Deuxième moitié des années 1970, invention du séquençage. - 1977 : Carl Woese.

Le gène codant les ARN ribosomique 16S est présent chez tous les procaryotes en plusieurs copies.

4 UNE REVOLUTION MOLECULAIRE - Deuxième moitié des années 1970, invention du séquençage : Carl Woese. Utilisation de la séquence de l ARN ribosomique 16S. Découverte du troisième domaine du vivant: les archées. Le gène codant les ARN ribosomique 16S est présent chez tous les procaryotes en plusieurs copies. Il est composé d'environ 1500 paires de bases et possèdent des zones conservées (amorces PCR) et des zones variables (la séquence change). La comparaison des séquences de plusieurs espèces ou souches est une analyse phylogénétique: classification moléculaire.

UNE REVOLUTION MOLECULAIRE ET TECHNIQUE - Depuis 1990 : Révolution des techniques de séquençage - 1989 : Génome Humain: 12 ans, 3 milliards de dollar - 2013 : Génome Humain: 1 journée, 1000 dollar -

5 UNE REVOLUTION MOLECULAIRE ET TECHNIQUE - Depuis 1990 : Révolution des techniques de séquençage : Génome Humain: 12 ans, 3 milliards de dollar : Génome Humain: 1 journée, 1000 dollar - Utilisation de ces nouvelles techniques en écologie microbienne : approche de métagénomique - Mer des sargasses (C. Venter, Science 2004) Litres d eau de mer filtré de 3 sites - Extraction d ADN, séquençage - 1, 37 Gbp nouvelles espèces microbiennes Approches de métagénomiques sur différents environnements : démonstration de la richesse et de la diversité Microbienne

6 30 phylums sur les 100 phylums bactériens décrits contiennent au moins un représentant cultivé (Achtman, 2008).

7 L ISOLEMENT, UN PROBLEME NON RESOLU DEPUIS 100 ANS.

8 Approches culturales classiques 1 ) Enrichissement : une fraction d un échantillon naturel est ensemencée dans un milieu de culture 2 ) Isolement : - Technique d isolement sur boîtes de pétri. (Koch 1881). Les bactéries se multiplient et forment des colonies sur la surface de la gélose. Milieu Marin : 0,001 à 1%. - Technique d isolement en série de dilution en milieu liquide

9 11020 espèces décrites et validées (DSMZ, 2011) Nombre d espèces estimées 10 6 Comment passer au haut débit en terme d isolement? Comment développer une plateforme d isolement Haut débit?

Nouvelles approches culturales Culture d extinction: Button, 1993. Schut, 1993. Connon, 2002. Rappé, 2002. Isolement de SAR 11. Cho, 2004. Stingl, 2007. Song, 2009. Kopke, 2005.

10 Nouvelles approches culturales Culture d extinction: Button, Schut, Connon, Rappé, Isolement de SAR 11. Cho, Stingl, Song, Kopke, Jusqu à 50 % des bactéries - Toujours mis en évidence par les approches moléculaires, jamais cultivé 48 Puits NH 4 : 1 µm PO 4 : 0.1 µm Carbone: 0.001% Dilution a l extinction 1-5 cellules distribuées par puits Eau de mer naturel

11 Microencapsulation: Zengler Nouvelles approches culturales

PROJET COCAGNE Joel Querellou, CPER 2007-2013 Mise au point d une plate forme d isolement haut débit de Microorganismes Equipement : - Acquisition d un automate de pipetage :

12 PROJET COCAGNE Joel Querellou, CPER Mise au point d une plate forme d isolement haut débit de Microorganismes Equipement : - Acquisition d un automate de pipetage : ROBOT - Acquisition d un cytomètre de flux - Acquisition d une enceinte anaérobie - Acquisition d un microscope motorisé Personnel : - Recrutement d un ingénieur et d un technicien KBBE : Improved cultivation efficiency of marine microorganisms «MACuMBA» Marine Microorganisms : Cultivation Methods for Improving their Biotechnological Applications. - Isoler un grand nombre de nouvelles espèces microbiennes - Augmenter le nombre de microorganismes d intérêt biotechnologiques - Développer des méthodes de cultures haut débits

13 - Automate de pipetage : Hamilton, Starlet 8 canaux. - Filtre HEPA - Chargement de 20 microplaques 96 puits, 2,2 ml. - Lecteur de Code bar Etape 1 : Distribution de N cellules: 1920 cultures ou de 1 microgouttelette. Phase d incubation. Etape 2 : Détection de croissance: seuil 10 5 cells/ml. Etape 3 : Redistribution: les puits positifs, croissance, sont repiqués. Etape 4 : Extraction D ADN, Amplification de l ADNr 16S, Séquençage Etape 5 : Conservation, mise en collection des bactéries (Souchothèque de Bretagne)

14 L isolement haut débit est démarré : - Echantillon de Méditerranée, de la rade de Brest, de l océan Atlantique microplaques en incubation, cultures - Culture aérobies, température d incubation 16 C - Nous sommes à la troisième étape : Redistribution - Obtenir rapidement les premières séquences Le Robot nous permet donc de : - Culture haut débit - D automatiser l ensemble des étapes - D obtenir rapidement des isolats

15 HALOPHILES ANAEROBIE HAUTE TEMPERATURE ACIDOPHILES

16 MERCI..

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