DLST (Double locus sequence typing) Une nouvelle méthode moléculaire pour le typage de Staphylococcus aureus
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- Noëlle Lépine
- il y a 8 ans
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1 DLST (Double locus sequence typing) Une nouvelle méthode moléculaire pour le typage de Staphylococcus aureus D.S. Blanc, G. Kuhn Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Lausanne Pulsed Field Gel Electrophoresis Similarity PFGE restriction profile PFGE type A16 A19 A12 A18 A A U C10 C10 C C C4 C30 C1 C5 B B10 B26 G Db Da F3 Ea E H 1
2 Double Locus Sequence Typing PFGE : méthode «gold standard» Avantages: Pourvoir discriminant élevé Versatile Disponible dans beaucoup de centres Désavantages: +/- cher long Comparatif Pas de standardisation Reproductibilité questionnable lorsque beaucoup d isolats sont comparés Entre laboratoires 2
3 PFGE (électrophorèse en champs pulsé) ADN chromosomique ADN plasmidique Digestion par enzyme de restriction coupant rarement Séparation des fragments d ADN dans un gel d agarose Comparaison des bandes: 1 Isolat #1 Isolat #2 Tolérance de la position des bandes Type: A A 3
4 Comparaison des bandes: 2 Isolat #1 Isolat #2 Isolat #100 Tolérance de la position des bandes Type: A1 A2 A3 Méthode basée sur les séquences Définition définitif du type: ATGCCCCAATGCCTAGCATA = allèle 1 ATGCACCAATGTCTAGCATA = allèle 2 Données non ambiguës 4
5 Méthode basée sur les séquences Avantages: Reproductible Définitive (données non ambiguës) Création de base de données internationale Désavantages: Cher pas versatile Se base sur une très petite partie du génome Développement d une nouvelle méthode de typage pour S.aureus (MRSA) Remplacer le PFGE Utilisation pour l épidémiologie locale (transmission de patients à patients, épidémies ) Pouvoir discriminant aussi élevé que le PFGE Utilisation pour l épidémiologie à long terme (suivit des clones à un niveau international) Le temps et le prix de l analyse ne devaient pas être plus élevé que le PFGE 5
6 Séquences analysées clfa 498 bp, 27 R S A SD Repeat Region (R=18bp; N=12-53) W M clfb fnba S A 508 bp, 25 R SD Repeat Region (R=18bp; N=21-50) S A B B C DDDDD W R M W W C M spa 501 bp, 13 R S E D A B C W W R C (R=24bp; N=6-16) M Souches analysées 48 isolats divers 9 isolats provenant de 6 CCs 23 isolats de 12 clones épidémiques 14 isolats sporadiques 48 isolats apparentés Tous ont entre 0 to 6 bandes de différences avec le PFGE Isolés entre en Suisse romande (clone endémique) 24 paires d isolats provenant de porteur à long terme 214 à 1722 jours entre le 1 er et le 2 ème isolat 6
7 Nb de types = 10 Nb de types = 10 Nb de types = 5 Nb de types = 10 7
8 Nb de génotypes et pouvoir discriminant All isolates (N=144) Related MRSA (N=48) Diverse MRSA (N=48) No. of genotypes DI No. of genotypes DI No. of genotypes DI PFGE clfb r_spa_3p clfa r_spa_3p clfa r_clfb r_3p spa spa_3p clfb r clfa r clfb r_3p clfa r_3p clfb r_5p clfa r_5p fnba r spa_5p fnba r_3p fnba r_5p MLST n.d. n.d. n.d. n.d Stabilité des marqueurs Patient # Delta days PFGE* clfar clfar_3p500 clfbr clfbr_3p500 fnbar fnbar_3p500 spa spa_3p x12 i 1x12 i - - 1x24 d, 1x48 d 1x48 d m x174 d x54 d m x18 d m
9 Matériel et Méthodes Garder les souches sur plaques gélosées 1 x / sem. Faire une culture liquide (BHI) de chaque souche Remplir une plaque 96 puits Congeler à 20 C Storage of isolates Manifold Vacuum (Millipore) Growth in BHI DNA extraction and purification PCR and Sequencing 2 days of manipulations Capillary Sequencer (AB) 9
10 Conclusions DLST avec spa_3p500 et clfb_3p500: DP comparable au PFGE Stable sur une période entre 2-4 ans Transmission possible lors d épidémie uniquement si les isolats ont le même DLST type Suivit des clones à un niveau international: doit inclure les types apparentés. Snapshot analysis DLST: 2 allèles Définition: génotypes qui ont une allèle en commun sont des «single locus variants» (SLV) Ex: 2-2 et 2-31 ou 2-31 et 7-31 Snapshot: regrouper les génotypes qui ont des allèles en commun 10
11 Snap shot DLST MRSA
12 Comparaison DLST - PFGE Epidémiologie des MRSA au CHUV PFGE DLST PFGE non-typé others Clone G Clone F Clone E Clone D Clone C Clone B Clone A DLST others 4-x;X x;x x;x x; x
13 Epidémies CHUV 12 SG 12S MG URC TL URO WE 12N BV SICA RR 17S BE RMR PE 16N HS BB6 SG 15S SH 14S PA B5N HJP 12N PA HDN MR 15S CD URG CC B5N OA B5N SB 12N MD 14N DJ HDN HF DER RL 12S PP 16S BB 11S BP 15S PA 13N HJ N3O AP 13S HC HDN GO 16N LML 15S BF URG BE 13N BL HDN NC RMR DJ 16N DW 16N RM 16N PS SICA ?-? 2 TH DER TC 12S DSJ BB7 BP HDN SH 16N RRM 16N PY 15N AAM URC ?-? FM CPO BD SICA BW RESP BP 16N BEP 16N BJ 16N PF 16N DG 16N ?-37 Semaines Analyse des MRSA d un EMS Dépistage MRSA chez tous les résidents: env. 15 % positifs Transmission importante à l intérieur de l EMS? Résultats typage moléculaire: DLSType personnes DLSType personnes DLSType personnes DLSType personne DLSType personne DLSType personne Introductions multiples de MRSA dans l EMS et transmission modérée 13
14 Epidémiologie moléculaire des MRSA en Suisse romande Autres 4-x et x non-typé Autres types Clone G Clone F Clone E Clone D Clone C x et x x et x x et x Clone B Clone A Annual number of cases (one isolate per antibiogram per patient and per year) Surveillance des MRSA en Suisse romande: Situation actuelle Basée sur les souches envoyées par les laboratoires (une par patient par année) Volontaire fidèles ("sentinelles") occasionnels jamais Desserte du laboratoire peut varier d une année à l autre Nouveau/perte d un marché pour un laboratoire privé Restructuration d un laboratoire suite par exemple à un rachat Variations qui rendent la surveillance difficile 14
15 Surveillance des MRSA en Suisse romande: Proposition pour le future Typage de toutes les souches reçues par le laboratoire Vaud: selon mandat SSP Autres cantons: accord avec laboratoires sentinelles Obtenir une image sur la diversité des souches (pas de fréquence) Surveillance épidémiologique par hôpitaux de soins aigus "sentinelles" Vaud: un site par région (centre, est, ouest, nord) Autres cantons: un ou deux site selon accord Travail avec les équipes locales HPCI Obtenir des données de surveillance moléculaire des MRSA (définition d un cas, dénominateur commun, fréquence, tendances) 15
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