ALK et Cancer bronchique

Transcription

1 ALK et Cancer bronchique I Rouquette Service d Anatomie Pathologique Rangueil Plateforme génétique moléculaire des cancers (génotypage cancer du poumon)

2 Translocations, mutations, amplifications + ONCOGENE ALK C H R O M O S O M E CODE RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE KINASE 2

3 Inversion bras court du chromosome 2 Fusion exons 1-13 d EML4 /exons de ALK (région codant pour la TK ALK) GENE DE FUSION

4 Réarrangement EML4 ALK Fusion partie N-term.EML4 /portion intra-cellulaire du récepteur ALK : PROTEINE DE FUSION ONCOGENIQUE

5 Réarrangement EML4 ALK Dimérisation et Phosphorylation constitutive du domaine TK ACTIVATION VOIES PI3K/AKT RAS/MAPK

6 Variants les + fréquents V1 33% V3a/b 29% V2 9%

7 Quoi? Sur la plateforme on cherche Un réarrangement de l oncogène ALK conférant une sensibilité au crizotinib Chez qui? AMM traitement des patients adultes ayant reçu au moins un traitement antérieur pour un cancer du poumon non à petites cellules anaplasic lymphoma kinase (ALK) positif et avancé Comment? RT-PCR (reverse transcriptase PCR) FISH (hybridation in situ en fluorescence) IHC (immunohistochimie en paraffine)

8 RT-PCR (ARN) Mise en évidence des transcrits de fusion (le partenaire d ALK est identifié) Technique multiplexe: une amorce commune pour l exon 20 de ALK, amorces spécifiques pour le partenaire de fusion Très sensible, mais fragments amplifiés parfois très longs, donc mieux sur congelé Kits développés sur paraffine: 70% des variants détectés Confirmation nécessaire par une autre technique (faux négatifs)

9 FISH

10 Les sondes Sondes de «séparation» ( break-apart, split ): deux sondes de couleurs différentes s hybridant de part et d autre du point de cassure de ALK, rouge en 3, verte en 5. On n identifie que la cassure d ALK (partenaire?)

11 Sondes de «fusion» une sonde rouge pour ALK, une verte pour EML4 Sondes combinées: sonde de séparation + une troisième couleur pour le partenaire

12 Dako ALK FISH DNA Probe, Split Signal Y5417 sonde Vysis LSI ALK Dual Color Break Apart Rearrangement Probe From A Mc Leer Florin TriCheck (ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck Probe).

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14 Lecture Région tumorale préalablement sélectionnée par le pathologiste Filtres en rapport avec la longueur d onde des fluorochromes utilisés Au moins 100 noyaux intacts (pb petites biopsies) Distance split >=diamètre d un signal Seuil de positivité: 15% Double lecture Problème de l autofluorescence Si doute, vérifier par autre technique

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16 - Filtre DAPI λ excitation 365±12 nm / λ emission 397 nm - Filtre Rhodamine-rfp λ excitation 546±12 nm / λ emission 590 nm - Filtre FITC-gfp λ excitation 475±40 nm / λ emission 530±40 nm Spectrum Orange Gold. Excitation: 547 nm Emission: 572 nm Equivalent: Rhodamine Sonde split DAKO: texas red /FITC Sonde split Abbott: orange gold/fitc

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18 Impact du préanalytique Prélèvement Délai ischémie froide Fixation Biopsies 6/8h pièces 24/48h Recoupe mise en cassettes Inclusion enrobage Paraffine <60, démarrages WE Coloration biopsies Eosine autofluo, ADN Stockage blocs Stabilité en paraffine Support lames Superfrost IHC FISH Délai conservation lames 4 +/- enrobage 8 j

19 Ecrasements AFA: pas d hybridation Sous-fixation Os décalcification Autofluorescence éosine

20 Formol neutre tamponné Impact du préanalytique Attention durée de fixation (protocoles week-end). Décalcifiant = acide: si plusieurs sites métastatiques éviter de biopsier l os Pièces osseuses: rinçage acide, vérifier ph hypercentres Impact des colorants (éosine, autres): éviter de les utiliser Ne pas couper les lames trop longtemps avant la FISH et l IHC, les conserver à 4 C, les protéger.

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23 Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011 Pourcentage de résultats non interprétables 16,0% 14,0% 12,0% 10,0% 8,0% 6,0% 4,0% ADN non amplifiable Bloc épuisé % de cellules tumorales < seuil de détection 2,0% 0,0% EGFR act EGFR res KRAS BRAF PI3KCA HER2 ALK (FISH) Les taux de résultats non interprétables ont légèrement diminué depuis le début du programme Taux de NI élevé pour le test ALK en FISH (14%)

24 FISH coûteuse, consommatrice de temps

25 IHC ALK Anticorps disponibles 3 clones: ALK1, D5F3 et 5A4 sensibilité 92 à 100%, spécificité 99 à 100% Dilutions 1/25 e à 1/100 e selon amplifications, clones, automates

26 Marquage modéré à intense (++ à +++), cytoplasmique diffus, >50% Faible et focal si AFA ou sous-fixation

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28 X40 architecture acineuse

29 X2,5 ALK 5A4 x40

30 Scoring Score classique= Intensité x % CT positives H-score= (1 x % CT intensité à 1+) + (2x % CT 2+) + (3x %CT 3+) from weak and multifocal(1+) to strong and diffuse (2+) J Thorac Oncol. 2013

31 Discordances IHC -/FISH + : attention interprétation IHC, compter signaux en FISH. IHC+/FISH- : plus rare, être exigeant sur la FISH, repérage zone tumorale, compter les noyaux, double lecture, pertinence de la limite à 15%? Utiliser 3 e technique, contrôles hors site, EEQ

32 Discordances Tumeur hétérogène: les pneumocytes ont été comptés

33 Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011 Données globales : Taux de translocation en FISH : 5,4 % Taux de translocation en IHC : 4,8 % Plateforme: 20% 1 er trimestre, 4,7% dernier trimestre Stratégies des laboratoires : FISH uniquement : 10 FISH + IHC en parallèle : 5 IHC + FISH de confirmation : 21

34 Virchows Arch (2012) Thunnissen et al

35 Diagnostic algorithm for ALK fusion from the Japanese Lung Cancer Society From Front. Oncol., 2012 Murakami

36 Sholl J Thorac Oncol. 2013

37 Plateforme séquentiel EGFR IHC ALK EGFR MUTE ALK IHC - IHC ALK - IHC ALK + STOP Prescription ou Profil ALK FISH EGFR18 KRAS BRAF HER2 PI3K ALK + ALK -

38 Résistances acquises au crizotinib Doebele Clin Cancer Res 2012

39 Résistance au crizotinib Mutations domaine Tkinase ALK (Doebele Clin Cancer Res 2012) L1196 M Saturation site de liaison F1174C Favorise l activation conformationnelle du RTK G1279A D1203N Giroux

40 Conclusion Technique de référence: FISH «time consuming»+ impact préanalytique: aide des systèmes de traitement d images. Place de l immunohistochimie dans le screening, mais quelques discordances Importance de l organigramme choisi (résultats des études nationale et internationales en cours) RT-PCR réservée à des cas particuliers Intérêt de la recherche des mutations de résistance?