«Plasmacytoid dendritic cells sense skin injury and promote wound healing through type I interferons» Josh Gregorio et al., 2010

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1 «Plasmacytoid dendritic cells sense skin injury and promote wound healing through type I interferons» Josh Gregorio et al., 2010 Plan détaillée de la présentation I- Introduction aux cellules dendritiques plasmacytoïdes (pdcs) A- Caractérisation initiale de la sous-population de cellules dendritiques plasmacytoides - Par des marqueurs de surface : o Lin-/ITL3+/ITL1- o B220+/CXCR3+/CD62L+ o BST2+ (=PDCA) B- Caractérisation morphologique et fonctionnelle - Morphologie de cellules dendritiques à morphologie voilée - Réponse à l infection virale C- Problématique - Existe-t-il un lien entre cicatrisation d une blessure cutanée et les cellules dendritiques plasmacytoïdes? o Mécanismes? o Danger(s) d un tel système? II- Cellules dendritiques plasmacytoïdes, une nouvelle fonction? (analyse de la publication) A- Modèle de blessure utilisé «tape stripping» : écorchure B- Infiltration des pdcs au sein du tissu lésé? C- Activation des pdcs au site de blessure? 1- Recherche de preuve de l activation des pdcs infiltrés a) Production de cytokines? (IFN-I, approche par gain dans le phénotype) b) Effet de la déplétion en pdcs? (approche plus informative par perte dans le phénotype) 2- «Signal de danger», «maturation du signal de danger» et transduction du signal a) Signal de danger? Acides nucléiques du soi b) Détection du signal de danger et «Toll-like receptors» TLR 7/9 mis en jeu (démonstration par perte de fonction : inhibiteurs, KO TLR/adaptateurs de la voie de transduction) c) Maturation extracellulaire du signal de danger et peptides antimicrobiens Rôle des cathélicidines (LL37 chez l homme, CRAMP chez la souris) dans cette maturation. d) Maturation extracellulaire du signal de danger et peptides antimicrobiens D- Réponses induites par les pdcs dans le cadre d une blessure cutanées 1- Profil cytokinique du site de blessure Approche par perte de phénotype : o Déplétion en pdcs : profil cytokinique relatif aux LTh-17 diminué o Perte de fonction (souris KO) du récepteur IFN-I : profil cytokinique émanent des LTh-17 diminué fortement. CHESNAIS Virginie CARPIER Jean-Marie

2 2- Réponse du tissu lésé Approche par marquage immunohistochimique (spécifique de la keratine 6) : reépithélialisation = «cicatrisation». III- Voie de «cicatrisation» médiée par pdcs et maladies autoimmunes A- Récapitulatif de la voie médiée par les pdcs B- Le psoriasis - Les keratinocytes psoriatiques expriment constitutivement des cathélicidines - La réponse inflammatoire précoce médiée par les pdcs induit une réponse inflammatoire tardive médiée par les Th17 : o Sur le court-terme? : réponse essentiellement tissulaire, par migration et prolifération des cellules structurales du tissu. o Sur le long-terme? : réponse immunitaire non contrôlée au site de lésion - Dans le psoriasis, pas de «lésion» cutanée nécessaire : à mettre en corrélation avec les zones d apparition des éruptions cutanées? CHESNAIS Virginie CARPIER Jean-Marie

3 Les cellules dendritiques plasmacytoïdes Réaction inflammatoire et reépithélialisation des lésions cutanées «Plasmacytoid dendritic cells sense skin injury and promote wound healing through type I interferons» Gregorio et al., 2010 J.Exp.Med., vol.27, n 13, Cellules dendritiques plasmacytoïdes en Microscopie Electronique Jean-Marie CARPIER Virginie CHESNAIS

4 INTRODUCTION Système immunitaire : Les cellules dendritiques plasmacytoïdes CARACTERISATION INITIALE DE LA SOUS POPULATION Cella et al., 1999 Les cellules dendritiques plasmacytoïdes: sous-population lin - /ILT3 + /ILT1 - et B220+ / PDCA+ Sécrétion d interférons de type I 2

5 INTRODUCTION Système immunitaire : Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (Cella et al., 1999) CARACTERISATION MORPHOLOGIQUE ET FONCTIONNELLE Observation de pdcs en microscopie optique Activation des pdcs suite à différentes stimulations Aspect «voilé» avec quelques dendrites Rôle dans la réponse immune antivirale par sécrétion d INF de type I 3

6 INTRODUCTION Système immunitaire : Les cellules dendritiques plasmacytoïdes ADN ou ARN viral Réponse à l infection virale Activation des lymphocytes T VOIE DE REPONSE IMMUNE MEDIEE PAR LES pdcs 4

7 PROBLEMATIQUE Existe un lien entre cicatrisation d un épithélium et les cellules dendritiques plasmacytoïdes? Quels en sont les mécanismes? Quels en sont les dangers? I. Modèle de lésion cutanée chez la souris II. Infiltration et activation des pdcs au niveau de lésions cutanées 1. Peuplement en pdcs au site de lésion 2. activation des pdcs - mise en évidence de la production d interférons (IFN-I) - mise en évidence de la voie de signalisation - rôle des cathélicidines III. Réponses induites par les pdcs III. Maladie autoimmune : psoriasis 5

8 Modèle utilisé Modèle de lésion cutanée induit par écorchure 4. Reépithélisation Lésion 2. Médiateurs de l inflammation 3 Quantification du nombre de cellules dermales (contrôle d infiltration) 3. Infiltration de cellules du SI Principe du modèle de lésion cutanée sur la souris L épiderme est enlevé mécaniquement en conditions hautement stériles jusqu à la couche basale. Entraîne une réponse inflammatoire et une reépithélialisation. 6

9 INFILTRATION DES pdcs Système immunitaire : Les cellules dendritiques plasmacytoïdes Lésion cutanée Infiltration? VOIE DE REPONSE INFLAMMATOIRE MEDIEE PAR LES pdcs 7

10 INFILTRATION DES pdcs Cellules CD11b+ Gr-1+ Neutrophiles Cellules CD3+ Leucocytes T Cellules PDCA-1+ B220+ pdcs Analyse en cytométrie de flux de population cellulaire au niveau d une lésion cutanée Infiltration de cellules dendritiques plasmacytoïdes - Parallèle aux neutrophiles - Transitoire 8

11 ACTIVATION DES pdcs Lésion cutanée Infiltration Activation? VOIE DE REPONSE INFLAMMATOIRE MEDIEE PAR LES pdcs 9

12 ACTIVATION DES pdcs Y a-t-il production de cytokine dont l interféron de type I dans différentes conditions de déplétion (pdcs, neutrophiles)? (Approche par perte de phénotype, informatif) IFN-α : seraient produits uniquement par les pdc infiltrés IL-6 : production précoce par les kératinocytes endommagés et par les pdcs TNF : production par les neutrophiles puis relayée par d autres cellules. Quantification de l expression d ARNm d IFNα et de cytokines proinflammatoires (IL-6 et TNF) Activation des pdcs qui produisent des INF-I 10

13 ACTIVATION DE pdcs Lésion cutanée Infiltration Voie de transduction médiée par les TLR? VOIE DE REPONSE INFLAMMATOIRE MEDIEE PAR LES pdcs 11

14 ACTIVATION DES pdcs voies d activation Comment les pdcs «ressentent» le signal d activation (Acides nucléiques extracellulaires)? METHODE IRS 954 (oligont inhibiteur TLR 7/9) (7/9) Souris KO Approche par pertes de fonction au sein de la voie TLR 12

15 ACTIVATION DES pdcs voies d activation Comment les pdcs «ressentent» le signal d activation (Acides nucléiques extracellulaires)? (Approche par perte de fonction au sein de la voie TLR) Inhibition de la voie de transduction des toll like receptor Pas de production de IFN-I Inhibition des toll like receptor Pas de production de IFN-I Quantification de l expression d ARNm d IFN-I Activation des pdcs qui produisent des INF-I se fait par l intermédiaire des récepteurs toll like TLR 7 et 9. 13

16 ACTIVATION DE pdcs Lésion cutanée Infiltration Kératinocytes endommagée a. Nucléiques libres VOIE DE REPONSE INFLAMMATOIRE MEDIEE PAR LES pdcs 14

17 ACTIVATION DE pdcs Système immunitaire : Les cellules dendritiques plasmacytoïdes Lésion cutanée Induction de l infiltration de pdcs Kératinocytes endommagés Induction d ARNm d IFNα a. Nucléiques libres Rôle de la cathelicidine? Induction d ARNm CRAMP VOIE DE REPONSE INFLAMMATOIRE MEDIEE PAR LES pdcs 15

18 ACTIVATION DES pdcs Rôles des cathélicidines La conversion des acides nucléiques de l hôte par les cathélicidines a-t-elle un rôle dans l activation des pdcs dans le cadre du modèle de blessure utilisé («tape-stripping»)? 1. Injection de cathelicidin (CRAMP) sur une peau saine 2. Souris mutantes Cramp -/- Quantification de l ARNm d INF-I Cathelicidine : permet d induire l activation des pdcs et production d INF-I Mais pas indispensable (autre voie?) 16

19 REPONSE INDUITE PAR LES pdcs Lésion cutanée Infiltration Kératinocytes endommagée a. Nucléiques libres Cathelicidine Réponse induite? VOIE DE REPONSE INFLAMMATOIRE MEDIEE PAR LES pdcs 17

20 REPONSES INDUITES PAR LES pdcs réponse inflammatoire et reépithélisation Quantification de l ARNm de cytokines inflammatoires et d INF-γ Production des cytokines Th-17 nécessite la présence de pdcs Production des cytokines Th-17 nécessite la production d INF-I Suivi des cellules kératine-6 par immunofluorescence au niveau d une lésion cutanée Activation des pdcs (production des INF-I) permet d induire une réponse inflammatoire médiée par les lymphocytes Th17 et une reépithélisation 18

21 INITIATION Bilan, avancées et hypothè REPONSE INFLAMMATOIRE PRECOCE RECRUTEMENT/MIGRATION ACTIVATION Site de blessure Libération d ADN appartenant au soi originaire des cellules lésées Kératinocyte non lésé (TLR3) Facteurs? CXCR3-L Sécrétion constitutive de chémokines (chémérine) Modulation de recrutement des pdcs Activation TLR7/9 Conversion des acides nucléiques du soi pdcs activés Endothéliocytes et fibroblastes Sérine protéases libérées ADN Cathélicidines Kératinocyte lésé CONSTITUTIF Kératinocyte psoriatique Kératinocyte non lésé

22 s dans le modèle proposé REPONSE IMMUNITAIRE TARDIVE ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE INFILTRATION ET SIGNAUX DE SURVIE DES TH-17 REPONSE TISSULAIRE RI NON CONTROLEE OL IIr Site de blessure IL-23 IL-12 IL-6 INDUCTION Sécrétion de chimiokines Survie des Lymphocytes TH-17 Expression d IL-17 Expression d IL-22 Infiltration tissulaire de macrophages Circulation INFLAMMATION +++ Pas d expression d IL-17 LTh 17 Expression IL-17 Migration + prolifération Reépithélialisation = CICATRISATION Pourcentage de cellules au niveau du site de blessure

23 PSORIASIS et maladies auto-immunes Le psoriasis est une maladie auto-immune chronique -Présence de pdcs au niveau de la peau -Hyperprolifération des kératinocytes -Surexpression de cathélicidines au niveau des keratinocytes psoriatique 19

24 ANNEXES 20

25 ACTIVATION DES pdcs Y a-t-il production de cytokine dont d interféron de type I? (Approche par gain dans le phénotype ) Induction de l infiltration des pdcs Quantification de l induction d ARNm d IFNα et de cytokines proinflammatoires (IL-6 et TNF) Hypothèses : IFN-I : seraient produits uniquement par les pdcs infiltrés IL-6 : production précoce par les cellules du tissus (kératinocytes) TNF : production par les cellules infiltrées puis relayée par d autres cellules. 21

26 ANNEXES INFILTRATION DE CELLULES DENDRITIQUES CONVENTIONNELLES 22

27 ANNEXES DEPLETION EN pdc (Anticorps anti-bst-2/mab927) 23

28 ANNEXES Démonstration in vitro du rôle de la cathélicidine dans l activation des pdcs 24

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