3. Biotechnologie de l ADN

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1 3. Biotechnologie de l ADN 3.1. Technologie de l ADN recombinant Isolation d ADN et d ARN Fragmentation de l ADN (les Endonucléases) Analyse d ADN sur d agarose et d acrylamide Les vecteurs de clonage La ligation Transformations de bactéries Techniques d hybridation d acides nucléiques 3.2. Le séquencage 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase (PCR)

2 Les vecteurs de clonage Vecteur de clonage : élément génétique capable d autoréplication qui sert à porter un fragment d ADN étranger et à l introduire dans une cellule hôte. gène de résistance à l antibiotique, ampr MCS : région apte à recevoir un fragment d ADN exogène qui consiste en une série de différents sites de reconnaissance des enzymes de restriction mis bout à bout. site multiple de clonage, MCS Vecteur plasmidique 1,2-3,0 kb origine de réplication, ORI ORI : sur cette région est enclenchée la réplication du plasmide de façon indépendante de la réplication du chromosome bactérien. Ampr : gène qui confère la résistance à un antibiotique. Ici, le gène code pour la béta-lactamase qui dégrade l ampicilline.

3 Les vecteurs de clonage : obtenir de l ADN recombinant An Introduction to Genetic Analysis ADN recombinant : toute molécule d ADN formée en réunissant des segments d ADN de différentes sources.

4 La ligation : appariement des bouts collants complémentaires ADN à cloner ADN vecteur Le plasmide est incisé, produisant une molécule linéaire à bouts collants. EcoRI EcoRI Les extrémités des fragments d ADN produits par la même enzyme de restriction vont s apparier aux bouts collants complémentaires. appariement des bouts collants complémentaires ADN ligase + 2ATP ADN recombinant

5 La ligation : Union des bouts collants Les brins d ADN sont soudés par l ADN ligase en présence d ATP. Elle introduit des liaisons covalentes entre le 3 -OH et le 5 - phosphoryle entre deux nucléotides. Molecular Cell Biology

6 Transformation de bactéries fragments d ADN ADN inséré de max kb EcoRI Ampr plasmide recombinant Ampr vecteur plasmidique ori transformation ori colonies résistantes à l ampicilline agar avec ampicilline ADN bactérien cellules portant des mêmes plasmides recombinants, ou clone d ADNc

7 3.2. Le séquencage : la méthode de Sanger ddntp : absence d un groupement OH en position 3. L incorporation d un ddntp arrête la synthèse d ADN. Pourquoi? L utilisation des ddntp permet d obtenir un ensemble de fragments d ADN de différents tailles, selon l endroit où un ddntp se sera inséré et que la réaction aura ainsi été stoppée.

8 3.2. Le séquencage : la méthode de Sanger ddg dda ddt ddc Préparation du gel du polyacrylamide Dénaturation et dépôt sur gel Migration par électrophorèse

9 3.2. Le séquencage : la méthode de Sanger

10 3.2. Le séquencage : la méthode de Sanger Transfert du gel sur papier filtre (Whatman 3MM) Séchage du gel Cassette autoradiographique (+ écran amplificateur) Développement du film autoradiographique Lecture sur table lumineuse Saisie sur ordinateur Longueur typique de lecture : 400 nucléotides Durée totale de l expérience : environ 3 jours

11 Exercice : Donnez la séquence déterminée sur ce gel La séquence est 5 -GGCATAC-3 ; Quel ddntp est présent dans chacune des quatre réactions chargées?

12 Exercice : Donnez la séquence déterminée sur ce gel La séquence est 5 -GGCATAC-3 ; Quel ddntp est présent dans chacune des quatre réactions chargées? 5 -G C C A T T G C A-3 A G C T

13 3.2. Le séquencage : template + polymerase + dctp dttp dgtp datp ddatp ddgtp ddttp ddctp extension electrophoresis A T G C A T T A C G T A G C G C A T G C T A T A C G T A G C A T

14 3.2. Séquençage automatique Exemple de l ABI PRISM 310 Capillaire d électrophorèse

15 3.2. Le séquencage : Exemple d'enregistrement obtenu à partir d un séquenceur automatique Les séquenceurs permettent de lire plusieurs centaines de nucléotides avec une très bonne qualité, jusqu à 1000 pour les appareils les plus performants!

16 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase ( PCR) : le premier cycle Brins complémentaires d ADN séparés amorces Synthèse d ADN X paires de nucléotides L ADN est dénaturé et ensuite associé à un excès de deux oligonucléotides synthétiques. Les deux oligonucléotides vont s apparier à l ADN simple-brin et servir d amorces spécifiques pour une synthèse d ADN in vitro.

17 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase ( PCR) : l amplification exponentielle Premier cycle (2 molécules d ADN double brin) Deuxième cycle (4 molécules d ADN double brin) Troisième cycle (8 molécules d ADN double brin)

18 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase ( PCR) : le protocole «type» Le protocole consiste d une répétition de cycles de 25 à 40 fois qui comporte trois étapes : (1) Dénaturation : 30 sec à 94 C (2) Hybridation : 30 sec à C (3) Elongation : 1 min par kb à synthétiser à 72 C La PCR est basée sur l utilisation d une ADN polymérase particulière, la Taq, isolée d une bactérie thermophile. La Taq polymérase n est pas dénaturée par les traitements thermiques répétés à 94 C.

19 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase ( PCR) : les trois espèces de séquences nucléotidiques présentes Après plusieurs cycles, la population des molécules d ADN est dominée par un seul fragment dont la longueur correspond à la distance entre les deux amorces.

20 3.3. La réaction en chaîne en présence de polymérase ( PCR) : Quelques polymérases thermostables Type Taq : sans activité exonucléase 3 vers 5 ; ne pas besoin d un grand nombre de molécules de matrice pour générer une importante quantité d ADN amplifié ; taux d erreur élevé ; ajoute toujours une adénine débordante sur l extrémité 5. Pwo : possède une activité exonucléase 3 vers 5 (activité de correction) ; taux d erreur très bas ; polymérase hautement fidèle mais exige un nombre de molécules de matrice initiale élevé. Expand : mélange d enzymes Taq et Pwo ; nécessite un petit nombre de molécules de matrice primaire ; ajout des adénines 5 débordantes sur environ 50% des molécules synthétisées ; possèdent une activité de correction.

21 3.4. La PCR quantitative : le Lightcycler

22 3.4. La PCR quantitative : agents se liant à l ADN double brin (Lightcycler assay) Les agents exhibent peu de fluorescence pendant qu ils sont libre en solution. Leur émission augmente lorsqu ils sont liés à l ADN sans inhiber la réaction. Les mesures se font à la fin de la phase d élongation.

23 Modèle graphique de la PCR en temps réel Plus il y a de matrices à amplifier au départ, moins sera le nombre de cycles requis pour atteindre un point où le signal d émission de fluorescence sera significativement plus élevé que la ligne de base. Ce point est défini comme étant le cycle seuil, Ct. Il peut être traduit en résultat quantitatif en le comparant avec des cycles seuil générés avec des matrices de quantité connue.

24 3.4. La PCR en temps réel : la technologie «Taqman» La technologie Taqman est basée sur l activité 5 exonucléase de la Taq polymérase. Un fluorochrome emetteur est fixé à l extrémité 5 de la sonde d hybridation et son emission est inhibée par un second fluorochrome suppresseur présent à l extrémité 3. La sonde hybridée est hydrolysée par la Taq lors de l élongation, le reporter est alors libéré du suppressor permettant ainsi l émission de fluorescence.

25 La PCR en temps réel ou PCR quantitative Elle est basée sur la détection et la quantification d un reporter fluorescent dont l émission est directement proportionnelle à la quantité d ADN amplifié pendant la réaction de PCR. Théoriquement, il existe une relation quantitative entre la quantité de la séquence cible (ou matrice) de départ et la quantité du produit amplifié Afin de recueillir des données quantitatives précises, l échantillon doit être analysé dans la phase exponentielle d amplification quand les réactifs sont encore présents en excès. Après un certain nombre de cycles, l ADN amplifié est présent en grande quantité et sa renaturation entre en compétition avec l hybridation des amorces dont la quantité baisse de plus en plus. La réaction entre dans une phase linéaire et le taux d amplification devient extrêmement variable. Suit une phase de plateau où le taux d amplification décroît à près de zéro générant très peu d ADN nouveau.