Cours de biochimie des acides nucléiques

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1 Module de BI 121 Cours de biochimie des acides nucléiques (Enseignante : Eve de Rosny)

2 Plan I - Introduction = présentation rapide Les acides nucléiques Rôle de l AD et de l AR Les nucléotides II Structure chimique des acides nucléiques Les différentes bases azotées ucléosides et nucléotides omenclature Cours 1 III - Chaines d AD et d AR Structure primaire Conventions d écriture IV - Structure tridimensionnelle (structures secondaires et tertiaires) AD (la double hélice, compaction) AR (transfert, ribosomiques et messagers) V - Propriétés physico-chimiques de l AD Absorbance Stabilité (dénaturation) VI - Méthodes d étude de l AD Manipulation de l AD (plasmides et enzymes de restriction) Principales techniques d analyse (électrophorèse) Applications pour la police scientifiques Cours 2 Cours 3

3 Pyrimidine C C C C Formule développée Formule semidéveloppée Formule semidéveloppée simplifiée (sans les ) C Cytosine (C) Thymine (T) Uracile (U) AD et AR AD AR

4 Purine Formule semi-développée Adénine (A) AD et AR Guanine (G) AD et AR

5 Le pentose C C C C C C C D-Ribose β-d-ribose β-d-2 désoxyribose 1

6 Le pentose : liaison -osidique 2 C C ucléoside (adénosine)

7 L acide phosphorique pk a = 11,9 P pk a = 2,1 pk a = 7,2 - P + - Forme majoritaire à A p physiologique 7,4 R R 2 - P + - Fonction ester phosphorique

8 ucléoside mono-phosphate Fonction ester phosphorique - P - 5 C 2 Base - P C 2 Base+ 2

9 ucléoside di-phosphate (liaison anhydre d acide) C 3 C P - P - - α 5 C P β - P - α 5 C Desoxythymidine 5 monophosphate Desoxythymidine 5 diphosphate

10 ucléoside tri-phosphate (liaison anhydre d acide) C 3 - P P - β P α - 5 C Désoxythymidine 5 diphosphate C 3 - P - γ P β P α 5 C Désoxythymidine 5 triphosphate

11 Dinucléotide Extrémité 5 C 3 (T) - P - - P R R Fonction ester phosphorique R Fonction diester phosphorique ou Phosphodiester - P - Liaison 3-5 phosphodiester α 5 C 2 P 3 - α C (A) Extrémité 3

12 Trinucléotide Extrémité 5 - P Liaison 3-5 phosphodiester - α 5 C 2 P α C 3 (T) C 2 P (A) α C 2 3 Extrémité 3 1 (G)

13 Quizz I 5 4 C Cette molécule est : A - du ribose B - du désoxyribose C du glucose IV Le carbone C6 est porté par A la base azotée B le ribose C le phosphate II III Il s agit d une base : A - purique B - pyrimidique C azotée Un nucléoside est formé de A une base azotée B une base azotée + un ribose C une base azotée + un ribose + un phosphate D une base azotée + un ribose + deux phosphates V Redonnez à chaque liaison numérotée son nom : - P P - P - A ester phosphorique B -osidique C anhydre d acide C 2 4 C 3

14 Découverte de la double hélice par Watson et Crick

15 Liaisons hydrogènes entre les bases (paires de bases) 9 C1 (désoxyribose) 6 2 δ- 1 δ+ δ+ δ- 4 C C1 (désoxyribose) δ- δ+ 6 4 δ+ δ C1 1 3 δ- (désoxyribose) C1 δ+ (désoxyribose)

16 Antiparallélisme - P - Extrémité 5 5 C 2 3 P - A T 5 C 2 3 P - Extrémité 3 2 C C G 5 C P Extrémité 3 2 C 5 - P 3 T A 2 C 5 - P Extrémité 5 -

17 La double hélice en chiffres élice B Un tour : 10 paires de bases Angle entre deux paires de bases 3,4 nm 2 nm élice droite

18 Petit et grand sillon Grand sillon C1 (désoxyribose) C 3 C1 (désoxyribose) Petit sillon

19 Condensation de l AD dans le noyau des cellules eucaryotes Cellule eucaryote en interphase Longueur totale de l AD chromosomique : 1,8 m, taille du noyau 10 µm Cellule eucaryote en phase de mitose

20 Condensation de l AD dans les bactéries AD génomique (le plus souvent circulaire) Plasmide 1 à 400 kb L AD a été artificiellement épaissi pour être visible Longueur d un AD bactérien : 1,6 mm, longueur d une bactérie 2 µm

21 Structure des AR Coiffe en 5 5 Structure d un ribosome bactérien range : ARr Bleu : protéines de la petite sous unité Vert : protéines de grande sous unité Rouge : antibiotique lié au ribosome Structure tertiaire AR de transfert Structure secondaire ARm (eucaryote) PolyA en 3

22 Ribosome Synthèse des protéines AR m AR t

23 Quizz I Quel est le nombre de liaisons hydrogènes entre une guanine et une cytosine A - 1 B - 2 C 3 IV Quelle est la molécule représentée?: A AD B AR messager C AR ribosomique D AR de transfert II Quel atome se situe à l extrémité 5 d un AD A Carbone V B xygène C Azote D ydrogène Que montre la flèche : A le grand sillon B le petit sillon III Parmi ces types de liaisons indiquez celles qui sont dîtes «faibles». Quelles sont celles qui stabilisent la double hélice d AD? A liaison hydrogène B liaison covalente C interactions hydrophobes Les protéines qui reconnaissent l AD se fixent : A dans le grand sillon B dans le petit sillon

24 Spectre d absorbance de l AD

25 Stabilité de l AD

26 Suivi de la dénaturation de l AD

27 Dénaturation de l AD

28 Plasmide AD bactérien extra-chromosomique Site de restriction 1 Site de restriction 2 Site de restriction 3

29 Amplification d un plasmide Etape 1 (extraction des plasmide à partir de bactéries) Lyse bactérie + Purification des plasmide Etape 2 (entrée du plasmide dans une autre bactérie) + Etape 3 (amplification du plasmide = multiplication de la bactérie) Etc.

30 Exemple de carte de restriction Position relative des sites de restriction sur un plasmide

31 Digestion enzymatique d'un vecteur et d'un insert par EcoRI

32 Insertion de l insert dans le plasmide

33 Electrophorèse Séparation de l AD en fonction de la taille (unité = paires de bases ou pb) Echelle de poids moléculaire - + Lumière blanche Lumière UV Bromure d ethidium

34 Electrophorèse avec un plasmide surenroulement

35 Southern Blot Coupures par enzymes de restriction Gel d agarose Membrane de nitrocellulose + Etc.. radioactif

36 Polymorphisme de longueur Séquences courtes en tandem Preuve par l AD Raphaël Coquoz CTGG CTGG CTGG CTGG CTGG Chromosome 1 Chromosome 2 Chromosome 1 Chromosome 2 Chromosome 1 Chromosome 2 Individu 2 (homozygote) Individu 3 (hétérozygote) Individu 1 (hétérozygote)

37 Détection du polymorphisme de longueur de fragments de restriction (par Southern Blot) 1 - Digestion des AD par des enzymes de restriction 2 migration sur un gel l électrophorèse 3 Southern blot incubation avec un fragment d AD radioactif complémentaire des séquences répétées (GACCGACC)

38 Exemple réel d un cas de viol Qui est l agresseurs?

39 Méthode utilisée aujourd hui (PCR) 1 Amplification des séquences répétées 2 migration sur un gel d électrophorèse 3 coloration du gel par du bromure d éthidium. e vont être visibles que les fragments amplifiés.

40 Le suspect est-il coupable? Exemple réel

41 Exemples de marqueurs utilisés par le FBI

42 Quizz I L AD et l AR absorbent fortement la lumières à : A 280 nm? B 260 nm? C 400 nm? IV L électrophorèse sépare l AD en fonction A de la charge B de la taille C de la séquence II Quelle séquence a la température de dénaturation (Tm) la plus élevée? A CACGATGA GTGCTACT V Est-il le père? B TGACTAGC ACTGATCG III Parmi ces séquences laquelle est susceptible d être reconnues par une enzymes de restriction? A TCGATT AGCTAA B AAGCTT TTCGAA

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