Travail à faire : Manipulation a effectué : 1

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1 Ndéye Fatou Mbow ICAA 3 Travail à faire : Manipulation à effectuer Introduction. But. Mode opératoire. Résultats obtenus. Interprétation et discussion. Conclusion. Manipulation a effectué : 1

2 Au cours de cette séance de travaux pratiques, nous avons eu à étudier le métabolisme glucidique, le métabolisme protidique, et l étude du type respiratoire, d une bactérie (le numéro 13) Lors de la 2éme séance de manipulation nous avons analysé microbiologiquement une eau impure. Introduction : Les analyses microbiologiques ne sont pas un indicateur fiable à 100 % de la qualité sanitaire des denrées produites destinées à la commercialisation, la conservation ou la consommation mais elles sont utiles. Elles nous renseignent sur le type des micro-organismes que renferme le produit à analyser car la principale cause de dégradation de ces denrées est les micro-organismes pathogènes. C est dans ce cadre que nous allons d abord étudier les métabolismes bactériennes en procédant à l identification avant de passer à l analyse alimentaire. But : Le but du TP consiste : Pour la première séance : étudier le métabolisme de la bactérie Pour la deuxième séance à faire une analyse microbiologique d une eau souillée : Dénombrement des flores aérobies mésophiles totaux sur milieu PCA. Dénombrement des coliformes totaux sur milieu DCL 1pour mille Mode opératoire : L étude des métabolismes Pour l étude du métabolisme glucidique =étude de la voie d attaque des glucides. On utilise le milieu Hajna-Kliger, qui permet la recherche de plusieurs caractères biochimique notamment l utilisation du glucose (culot), l utilisation du lactose (pente),production de H2S, production de gaz. 2

3 Etape préliminaire, d abord prendre une colonie dans la boite de pétrie 13 la mettre dans de l eau physiologique. Ensuite ensemençons abondamment la surface par stries serrées, puis le culot par simple piqure, à l aide de la même pipette boutonnée. Dévissons partiellement la capsule afin de permettre les échanges gazeux. Incubons pendant 24 H à 37ºC. Lorsque l on utilise le milieu Hugh et Leifson, un milieu semi solide agar qui permet de voir si la bactérie catabolise le glucose par voie fermentaire (en l absence d oxygène) ou par voie oxydative (en présence d oxygène). Apres l étape préliminaire, régénérons nos 2 milieux au bain marie bouillant à ºC. Ajoutons aseptiquement dans l un des tubes 3gouttes de la suspension bactérienne et 7gouttes de glucose 1% refermons le tube agitons légèrement avant de refermer le tube ne pas serrer le bouchon afin de permettre les échanges gazeux. Dans le 2 nd tube faisons la même expérience mais rajoutons y une couche de paraffine de 2cm de hauteur. Incubons pendant 24 H à 37ºC. Cette fois si on utilise le milieu Mannitol mobilité nitrate.le mannitol est un sucre réducteur composé par la liaison du glucose et du fructose. La bactérie va dégrader le mannitol pour libérer le glucose qui sera sa seule source de carbone.la dégradation du glucose s accompagne de l acidification du milieu le rouge de phénol devient jaune. Pour l étude de la mobilité on observe si la bactérie s est déplacée et à poussée tout au tour de la tube. Pour ce ensemencement pas de régénération du milieu, on fait une piqure centrale dans le tube ensuite incubons pendant 24 H à 37ºC. Le milieu Clark Lubs permet l étude de la voir de fermentation du glucose. Avec les produits de dégradation après fermentation. Les produits de fermentation peuvent être des acides mixtes qui sont mis en évidence par le test RM (Rouge de Méthyle), ou des acétoines qui sont mis en évidence par le test VP (Voges Proskauer). Etape préliminaire, d abord prendre une colonie dans la boite de pétrie 13 la mettre dans de l eau physiologique. Ensuite ensemençons largement, à l aide de la pipette boutonnée. Dévissons partiellement la capsule afin de permettre les échanges gazeux. Incubons pendant 24 H à 37ºC. Après les 24h avant la lecture des résultats faire le test (VP) c'est-à-dire ajoutons à chaud 2 gouttes alpha-naphtol +2gouttes de KOH dans l un des tubes. Dans le second tube faisons le test RM en ajoutant 2 à 3 gouttes de rouge de méthyl. Passons à la lecture. Tableau récapitulatif des résultats Milieu de culture Résultat Coloration 3

4 Hajna kliger Glucose sur le culot et lactose sur la pente Glucose + Lactose + H2S - Production de gaz + départ /arrivée Rouge/Jaune Rouge/Jaune Pas de noirceur Séparation du milieu Hugh et Leifson Tube sans paraffine : Glucose +. Tube avec paraffine : Glucose - Mannitol mobilité nitrate Mannitol + Vert/ Jaune Vert/ Vert Rouge/Jaune Clark et Lubs Mobilité + RM+ VP +./Rouge./Rouge Pour l étude du métabolisme protidique =étude de la voix d attaque des protéines. On commence avec le milieu Uree-Indole. L urée est hydrolysée par l uréase, que l on recherche avec production d indole. Pour l uréase la lecture est directe pour l indole on ajoute quelques gouttes de réactifs de kovaks. Pour la mise en évidence du TDA on met du FeCl. On ensemence directement une colonie dans le milieu puis on incube a à 37 C pendant 24H. Ensuite on enchaine avec le milieu Citrate de Simons.Ce milieu est un exemple de milieu synthétique, c'est-à-dire le milieu dont la composition, qui est complexe, est connue exactement tant qualitativement que quantitativement. Le caractère recherché est l utilisation de citrate comme seul source de carbone. 4

5 La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l anse, à partir d une suspension de la culture solide. Ne pas visser le bouchon à fond, afin de permettre les échanges gazeux. Mettre à l étuve a 37 C pendant 24h. Les milieux L.D.C. ; O.D.C. ;A.D.H.et témoin ces milieux sont utilisés pour la recherche des décarboxylases et dihydrolases bactériennes. Ces milieux sont tous 4constitués d eau distillée à la base de pourpre de bromocrésol de glucose et de NaCl, d extrait de levure. Pour le ODC il y a L-ornithine comme acide aminé, pour le ADH il y a le L-arginine comme acide aminé et enfin pour le LDC il y a le L-lysine comme acide aminé. Apres l étape préliminaire mettre une goutte de la suspension bactérienne dans les 4 tubes et incubons à 37 C pendant 24h. Tableau récapitulatif des résultats Milieu de culture Résultat Coloration départ /arrivée Uréé-indole Uréase - Jaune /Jaune Indole + TDA - Citrate de Simons Citrate de simons - Jaune/Annau rouge Jaune/Jaune Jaune / Jaune Milieu Témoin Milieu ODC Milieu ADH Milieu LDC Jaune/Jaune Jaune/Jaune Jaune/Violet Jaune/Violet 5

6 Maimona Kane Ndéye Fatou Mbow L analyse microbiologique d une eau souillée Dilution Les dilutions consistent à atteindre la concentration la plus faible pour effectuer une bonne analyse microbiologique de notre échantillon d eau souillée. Pour l obtention de la dilution 10 0 : On prélève 1ml du produit à analyser à l aide d une pipette graduée stérile et on le met dans la boite de pétri PCA. Pour l obtention de la dilution 10-1 : On prélève 1ml du produit à analyser à l aide d une pipette graduée stérile qu on va ajouter à 9ml d eau physiologique puis homogénéiser bien le contenu ; à partir de ce tube et avec la même pipette on prélève 1ml du produit et on le met dans la boite de pétri PCA. Pour l obtention de la dilution 10-2 : On prélève 1ml du tube de la dilution précédente (10-1 ) à l aide de la même pipette qu on va ajouter à un tube contenant 9ml d eau physiologique ; on jette la pipette. A l aide d une nouvelle pipette graduée stérile, on prélève 1ml du produit de ce tube et on le met dans la boite de PCA. A partir de la dilution 10-2 et de la même façon, on prépare les autres dilutions jusqu à 10-5 pour le milieu PCA et 10-3 pour le milieu DCL. Remarque : Les manipulations doivent être faites dans la zone stérile. Les dilutions doivent être faites en milieu aseptique. Homogénéiser bien les tubes entre chaque dilution. Changer les pipettes après chaque dilution. L ensemencement : a) Dénombrement en profondeur : Milieu PCA. A l aide d une pipette graduée stérile on prélève 1ml dans chaque tube qu on va ensemencer dans la boite de pétri correspondante a la dilution sur laquelle on va : écouler le milieu PCA fondu et refroidi à C ; homogénéiser légèrement ; Laisser se solidifier ; Laisser se solidifier à nouveau; ensuite retourner les boites de Pétri ; Incuber à l étuve réglée à 37 C pendant 24 heures ; b) Dénombrement en profondeur : Milieu DCL 6

7 A l aide d une pipette graduée stérile on prélève 1ml dans chaque tube qu on va ensemencer dans la boite de pétri correspondante a la dilution sur laquelle on va : écouler le milieu DCL fondu et refroidi à C ; homogénéiser légèrement ; Laisser se solidifier ; Laisser se solidifier à nouveau; ensuite retourner les boites de Pétri ; Incuber à l étuve réglée à 37 C pendant 24 heures. Tableau récapitulatif des résultats Flore Bactérienne F.A.M.T. 219/214 29/30 Colliformes totaux 82/81 : Nombre de germe /ml = n taux de dilution. Nombre de colonies = 219 /214 Taux de dilution = 10-3 nombre de germes FAMT = UFC FAMT = UFC Nombre de germe /ml = n taux de dilution 10. Nombre de colonies..= 29/30 Dilution..= 10-4 nombre de Colliformes totaux= UFC = UFC Interprétation : Au prima bord l ensemencement sur la gélose nutritive nous a permis de montrer la pureté de la souche. Elle s est effectuer en repiquant une colonie dans une eau physiologique ensuite en l ensemençant sur une boite de pétrie a 37 C pendant 24h. les résultats obtenus, pour le métabolisme glucidique, la bactérie utilise d abord le glucose 7

8 comme source de carbone ensuite il scinde le lactose pour dégrader le glucose.elle possède donc la Bétagalactosidase.La production de gaz est compréhensif car la dégradation du lactose s accompagne avec production de CO2.Pour le milieu High Leifson, la dégradation du glucose s est faite par voie oxydative, donc on peux en conclure que la bactérie est aérobie.pour le tube contenant la paraffine, nous n avons pas eu décoloration car cela est due a une erreur de manipulation car nous avons pas rajouter de glucose et de suspension bactérienne. Pour le milieu Mannitol mobilité nous pouvons dire que la bactérie possède l enzyme qui permet de dégrader le mannitol en glucose et fructose, afin d utiliser le glucose comme source de carbone. Nous avons à faire à une bactérie mobile. Le milieu Clark-Lubs nous a permis de nous rendre compte que les produis de dégradation âpres la fermentation du glucose par la bactérie sont les acides mixtes et les acétoines. Pour le métabolisme protéique ma souche ne possède pas d uréase donc l urée ne sera pas dégradée, cependant il possède de l indole. La bactérie ne possède pas de tryptophane désaminase donc pas de TDA. Pour le mannitol mobilité nitrate pour étudier l étude de la dégradation du nitrate on se penche sur le bouillon nutritive nitraté.on ajoute 3 gouttes de griess 1 griess2 si il y a coloration rouge présence de nitrate réductase si non on met du zinc si il y a coloration rouge alors la bactérie n a pas de nitrate réductase si il n y a pas de coloration alors la bactérie a dégradée le nitrate en nitrite puis le nitrite en azote donc la bactérie est nitrate réductase + nitrite réductase +.Lors de notre manipulation la bactérie étudiée est nitrate réductase + car après ajout de 3 gouttes de griess 1 griess2. Il y a coloration rouge. Pour le citrate Simmons la bactérie a trouvé une autre source de carbone. Les milieux de Falkov nous permettent de dire que notre bactérie possède les enzymes qui permettent la dégradation des 2 acides aminés qui sont le L-arginine et le L-lysine. Pour notre eau souillée elle est vraiment souiller avec les indices de contaminations fécaux, elle ne doit pas être ni consommer ni commercialiser. Conclusion : A partir des résultats obtenues, on peut conclure que l eau est contaminé par les germes totaux et elle ne doit pas être consommé ni commercialiser. Les bactéries présentent une activité métabolique importante et très intéressante à étudier. 8