CORRIGE. -> La région codante (ORF) dans l opéron tryptophane commence par une région leader qui contient plusieurs codons Trp en son sein

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1 CORRIGE 1 ère partie : Cours de Mr LE DREAN (30 minutes conseillées) (/5 points) L opéron tryptophane contient cinq gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse du tryptophane (trpe, D, C, B et A), groupés sous la dépendance d'un seul système promoteur/opérateur. Cet opéron est exprimé par défaut en absence de tryptophane et il est réprimé par 2 mécanismes complémentaires en présence de cet acide aminé (fixation d un répresseur sur l opérateur + phénomène d atténuation). 1 ère question (2,5 points) Pouvez-vous expliquer par quel mécanisme un promoteur est reconnu par l ARN polymérase chez les bactéries? - Chez les bactéries, la reconnaissance des promoteurs se fait par l enzyme ARN polymérase complète = Holoenzyme (composée des sous-unités alpha(x2), beta, beta prime et sigma) - La présence du facteur sigma est primordiale pour la reconnaissance car ce facteur modifie les propriétés de liaison à l ADN de l enzyme. Il permet une reconnaissance spécifique des promoteurs en se fixant sur 2 séquences d ADN particulières. - Les interactions entre les acides aminés de sigma, et les nucléotides de l ADN permettent de positionner l holoenzyme sur le gène (au bon endroit et dans la bonne direction) - Ces séquences sont : - la boite -35 (très importante pour la reconnaissance) - La boite 10 = boite Pribnow (attention malus si on cite la TATA-box qui est spécifique des eucaryotes) NB : les séquences consensus de ces boites ne sont pas à savoir Préciser pourquoi tous les promoteurs ne sont pas reconnus avec la même efficacité? - tous les promoteurs bactériens ne possède pas exactement la même séquence au niveau de ces boites -35 et -10 (ces séquences sont des séquences consensus, c'est-à-dire statistiques => promoteur par promoteur, il existe de nombreuses variantes) - Cette différence entraine une variation au niveau de l efficacité de la reconnaissance des séquences par sigma et il existe une relation directe entre l affinité de l ARN-pol pour le promoteur (mesuré in vitro) et la fréquence de transcription mesurée lorsque les gènes sont exprimés in vivo (= force intrinsèque des promoteurs) Quelle propriété doit avoir le promoteur de l opéron tryptophane pour que sa transcription se fasse par défaut? - Il faut que les séquences -35 et -10 soient optimales pour la reconnaissance par l ARN-pol. - Ainsi, l holoenzyme, peut se fixer sur le promoteur sans l aide d autre facteur, ce qui permet une expression par défaut. Dans ce cas, la régulation doit être négative => présence d un facteur répresseur qui empêche l expression constitutive du gène 2 ème question (2,5 points) : Expliquer à l aide de schémas précis et légendés, le phénomène d atténuation observé dans l opéron tryptophane (autrement dit, comment le couplage traduction/transcription régule l avancée de l ARN polymérase sur ce gène?). -> La région codante (ORF) dans l opéron tryptophane commence par une région leader qui contient plusieurs codons Trp en son sein -> Cette région est suivie de l atténuateur = région où l ARN en cours de synthèse peut prendre plusieurs structures en épingle à cheveux.

2 -> La formation de la structure d ARN dépend du positionnement du ribosome qui a commencé la traduction au niveau de la région leader. -> S il y a peu de Trp dans la bactérie => le ribosome est bloqué (ou ralenti) au niveau des codons Trp. Ce blocage laisse libre la région 2 qui peut ainsi s hybrider avec la région 3 -> Schéma de l hybridation des régions 2 et 3 de l ARN qui empêche la formation d un terminateur intrinsèque => donc l ARN-pol peut continuer son élongation. -> S il y a beaucoup de Trp dans la bactérie => le ribosome peut poursuivre la traduction malgré la présence des codons Trp -> En avançant, le ribosome détruit l hybridation des régions 2 et 3 de l ARN, ce qui permet une nouvelle hybridation (régions 3 et 4) -> Schéma du terminateur intrinsèque formé par l hybridation 3 & 4. -> la formation de ce terminateur provoquera l arrêt de la transcription. -> si notion de coordination dans le temps (timing) entre positionnement du ribosome et positionnement de l ARN-pol sur l ARNm en cours de synthèse. 2 ème partie : Cours de Mr HARDY (30 minutes conseillées) / 5 points Le mécanisme d'excision/épissage permet d'éliminer les introns et de rabouter les exons présents dans l'arn pré-messager. Donnz les différentes séquences impliquées dans la reconnaissance et l'élimination d'un intron (1,5 point) L'élimination des introns et le raboutage des exons par la réaction d'excision épissage nécessite la reconnaissance de plusieurs séquences consensuelles. Le site d'épissage 5' couvre la jonction entre l'exon en 5' et l'intron. Il correspond à la séquence consensuelle AG/GURAGU dans laquelle seuls les deux premiers nucléotides de l'intron GU sont invariant. La région 3' de l'intron est constituée de trois éléments distincts. 1 )Le site d'épissage 3' qui couvre la jonction entre l'intron et l'exon en 3'. Il correspond à la séquence consensuelle YAG/G dans laquelle les deux derniers nucléotides de l'intron AG sont invariants. 2 ) le site de branchement qui est situé 20 à 30 nt en amont du site d'épissage 3'. Il correspond à la séquence YNCURAY dans laquelle l'adénosine correspond au point de branchement. 3) une région riche en pyrimidines présente entre le site de branchement et le site d'épissage 3'. site 5 d épissage site de branchement site 3 d épissage AG GURAGU YNCURAY Y10-20 YAG queue polypyrimidine G Exposez à l'aide de schémas annotés, la mise en place séquentielle des différents complexes au sein desquels se déroule la réaction d'excision /épissage (3,5 point). L'excision des introns et le raboutage des exons est réalisé dans un complexe robonucléoprotéique appelé le spliceosome. Celui est composé de 5 ARNsn appelés U1, U2, U4, U5 et U6 associés à des protéines pour former quatre particules snrnp appelés U1 snrnp, U2 snrnp, U4/U6 di snrnp et U4 snrnp et de plus d'une centaine de protéines. L'assemblage du spliceosome in vitro est réalisé de manière séquentielle. 1 ) Formation du complexe d'engagement E. Recrutement de la snrnp U1 sur le site d'épissage 5' via une interaction directe par appariement de bases entre l'arn pré-messager et l'arnsn U1. Le point de branchement et la région riche en pyrimidine sont reconnus respectivement par le protéines BBP (Branch site Binding Protein) et U2AF (facteur auxiliaire de U2). La formation du complexe E ne nécessite pas d'apport d'énergie.

3 2 ) Formation du complexe A. U2snRNP aidé par BBP et U2AF interagit avec le site de branchement via une interaction directe par appariement de bases entre U2ARNsn et le site de branchement. L'interaction est complète sauf avec l'adénosine correspondant au point de branchement. Celle-ci fait alors saillie ce qui la rend plus réactive chimiquement. La liaison de U2 snrnp au site de branchement déstabilise les liaison de BBP et U2AF qui sont relargués du complexe. La formation du complexe A nécessite de l'atp. 3 ) Formation du complexe B. Arrivée de la ta trissnrnp U4/U6-U5 formée de l'association de la disnrnp U4/U6 et de la snrnpu5. La formation du complexe B nécessite de l'atp. 4 ) Formation du complexe C en présence d'atp. Cette formation correspond à un réarrangement des snrnp. La snrnp U6 interagit avec le site d'épissge 5' à la place de U1snRNP via une interaction directe entre l'arnsn U6 et l'arn pré-messager. U1 snrnp est relargué du complexe. Simultanément à son association avec le site d'épissage 5' l'appariement entre U4snRNP et U6snRNP est déstabilisé ce qui conduit au relargage de U4 snrnp du complexe. U6snRNP peut alors interagir avec U2 snrnp lié au site de branchement ce qui conduit à un rapprochement du site d'épissage 5' et du point de branchement. L'adénosine peut alors réaliser une attaque nucléophile de la liaison phosphodiester comprise entre la dernière base de l'exon et la première base de l'intron = première réaction de transestérification. La snrnp U5 va ensuite participer à l'alignement et au rapprochement des deux exons ce qui va permettre la deuxième réaction de transestérification. complexe E complexe A complexe B complexe C

4 Exercice (10 points) : La protéine Myoser est codée par un gène qui contient 3 exons (Figure 1). Ce gène est impliqué dans l'atrophie des muscles striés chez une souche de souris appelée Mdx. Pour déterminer l'origine de ce phénotype, l'expression du gène Myoser est étudiée par Northern blot et par Western blot avec différents tissus de souris contrôles et de souris Mdx (Figure 2). 1. Analyser et interpréter les résultats obtenus dans ces expériences de Northern Blot et de Western Blot. - analyse Northern blot L'ARNm Myoser a une taille de 1,3 kb. Il est présent en quantité plus importante dans le muscle strié que dans le cœur et il est absent dans les autres tissus étudiés. Il n'y a pas de différences entre les souris contrôles et les souris Mdx. - analyse Western blot La protéine Myoser a un masse moléculaire de 30 kda chez les souris contrôles. En accord avec l'expression de l'arn Myoser elle n'est présente que dans le muscle strié squelettique et le cœur et en quantité plus importante dans ce premier. Chez les souris Mdx, la protéine Myoser s'accumule en quantité similaire dans les deux tissus cependant sa masse moléculaire est réduite de 5 kda. - interprétation L'analyse du Northern blot suggère que le gène Myoser est transcrit spécifiquement dans le muscle strié squelettique et le cœur. Le phénotype de souris Mdx n'est pas du à une absence de transcription de ce gène dans les deux tissus concernés. L'analyse du Western blot suggère que le gène Myoser s'exprime spécifiquement dans le muscle strié squelettique et le coeur pour donner une protéine active de 30 kda. Chez la souris Mdx, la protéine ne faisant plus que 25 kda il y a une perte d'information qui doit la rendre non fonctionnelle. Le phénotype Mdx pourrait être du à la perte de fonction de la protéine Myoser. Remarque : beaucoup d'entre vous ne sont pas assez précis dans leur analyse et n'ont pas donné par exemple la taille de l'arnm, la masse moléculaire de la protéine etc 2. Est-ce que la taille de l'arnm Myoser, chez les souris contrôles, est en accord avec la structure du gène Myoser? Le gène Myoser possède trois exons et deux introns. Après transcription et maturation de l'arn pré-messager il y aura formation d'un ARNm qui comporte les trois exons plus une queue poly(a) d'environ 200 adénosines. Cet ARNm aura donc une taille de : Exon 1 (300 nt) + Exon 2 (200 nt) + Exon 3 (600 nt) + Queue poly(a) (200 nt) = 1300 nt ou 1,3 kb. La taille de l'arnm Myoser est donc en accord avec la structure du gène Myoser. 3. Déterminer, en justifiant votre réponse, la taille du cadre de lecture ouvert (ORF) de l'arnm Myoser chez les souris contrôles. Le cadre de lecture ouvert correspond à la séquence présente entre le codon initiateur (AUG) et le codon stop (UAA, UAG, UGA). On ne peut pas utiliser la séquence nucléotidique de l'adnc Myoser pour le déterminer car celle-ci est partielle. Le schéma du gène Myoser indique que le codon initiateur est positionné 100 nt en aval de l'extrémité de l'exon 1 par contre il n'y a aucune information sur le positionnement du codon stop. On peut par contre estimer la taille du cadre de lecture ouvert d'après la masse de la protéine Myoser. Celle-ci est de Da et un acide aminé a une masse moyenne de 100 Da. La protéine Myoser comporte donc 300 acides aminés chacun d'entre eux codés par trois nucléotides soit un cadre de lecture ouvert de 900 nt (ou 903 nt en ajoutant le codon stop).

5 Afin de mieux cerner le défaut d'expression du gène Myoser dans les souris Mdx. Le cadre de lecture ouvert du gène Myoser est amplifié par RT/PCR à partir d'arnm de muscle squelettique de souris contrôles et de souris Mdx. Pour réaliser cette amplification deux amorces spécifiques qui comportent à leur extrémité 5' un site (GAATTC) ont été réalisées. Amorce 1 : 5'-GAATTCGATGGCAGCACCCAGCCA-3' Amorce 2 :5'-GAATTCTTATACTGTCCTCTCTGC-3' 4. En considérant qu'il y a 100 molécules d'arnm Myoser dans l'extrait d'arnm de muscle squelettique placé dans le tube, exposer le protocole de RT/PCR mis en place pour amplifier 1 µg d'adn correspondant au cadre de lecture ouvert du gène Myoser. (Il vous est demandé de préciser les températures et les durées des différents cycles ainsi que le nombre de cycles). La première étape du protocole consiste à synthétiser de l'adnc (simple brin ou double brin = réponse OK) par reverse transcription selon le protocole suivant : Extrait ARNm + reverse transcriptase + dntps + amorce oligo d(t) ou amorce 2 La deuxième étape consiste à amplifier par PCR le cadre de lecture ouvert de l'adnc simple brin. Un cycle de PCR comportera : - une étape de dénaturation à 94 C (pendant 30 sec à 1 min). - une étape d'hybridation des amorces 1 et 2. Le Tm des amorces peut être calculé d'après la formule Tm = 2(A + T) + 4(G + C). Tm amorce 1 = 74 C et Tm amorce 2 = 66 C. On se place à une température légèrement inférieure au Tm le plus faible soit C. - une étape d'extension de l'amorce à 72 C pendant 1 min. Ce cycle sera répété n fois pour obtenir 1 µg d'adn correspondant à l'orf. 1 molécule ADN double brin de 900 pb aura une masse de 9000 X 660 = Da soit 9, g. On veut obtenir 1 µg d'adn soit 10-6 g i.e /9, = 1, molécules. Si on a 100 molécules au départ on veut donc avoir une amplification de 1, /100 = 1, On a donc 2 n = 1, soit n = log 2 (1, ) = Ln (1, )/ Ln (2) = 23,039/0,693 = 33 cycles Remarque : Un certain nombre d'entre vous n'a pas tenu compte que l'adn est double brin et ont multiplié par 330 au lieu de 660, dans ce cas on trouve 34 cycles. 5. Ecrire les 30 premières bases des extrémités 5' et 3' du brin codant du fragment amplifié à partir des ARNm de souris contrôles. 5'-GAATTCGATGGCAGCACCCAGCCAATTCAAT.// GAGTTTGCAGAGAGGACAGTATAAGAATTC-3' Le fragment amplifié à partir des ARNm de souris contrôles a été digéré par l'enzyme de restriction et inséré dans le site du vecteur d'expression procaryote pg-5 (Figure 3). De l'adn plasmidique, préparé à partir de cinq clones indépendants, a été digéré par les enzymes de restriction et et analysé par électrophorèse sur un gel d'agarose (Figure 4). 6. Quelles sont les caractéristiques du vecteur d'expression pg-5? - Le vecteur pg5 possède un gène de résistance à l'ampicilline qui permettra de sélectionner les clones bactériens ayant intégré le plasmide

6 - le vecteur pg5 possède un site multiple de clonage avec trois sites de restriction unique pouvant être utilisés pour l'insertion d'un fragment d'adn exogène. - Le vecteur pg5 possède une origine de réplication bactérienne ce qui permet sa réplication autonome dans la bactérie - Le vecteur pg5 possède le promoteur et l'opérateur du gène lacz. Ceci permettra de contrôler l'expression du cadre de lecture placé en aval. 7. Après avoir analysé le gel, indiquer, en justifiant votre réponse, le ou les plasmides qui permettront de produire une protéine recombinante Myoser Le plasmide 1 ND migre sous la forme de deux bandes qui doivent correspondre à de l'adn circulaire super enroulé (forme CC) et de l'adn circulaire relâché (forme OC). Après digestion par ou il migre sous la forme d'une seule bande d'adn linéaire d'une taille de 3kb. Le plasmide 1 correspond donc à du plasmide non recombinant. Les plasmides 2 à 5 ND migrent également sous la forme de deux bandes qui doivent correspondre à de l'adn circulaire super enroulé (forme CC) et de l'adn circulaire relâché (forme OC). Après digestion par on observe deux bandes d'adn linéaires de 3 kb et 0,9 kb. La bande de 3 kb correspond au plasmide et la bande de 0,9 kb correspond au fragment d'adn exogène (ORF). Ces quatre plasmides sont donc des vecteurs recombinants. On peut avoir théoriquement deux types de plasmides recombinants. P (150) (950) P (850) (950) XbaI (3500) A 3900 pb XbaI (3500) B 3900 pb PvuII (2400) (1700) PvuII (2400) (1700) La digestion par permet de discerner le sens d'insertion du fragment exogène. Seul le plasmide A permettra de produire la protéine Myoser. La digestion du plasmide A par produit deux fragments d'adn de 1550 nt et 2350 nt tandis que la digestion du plasmide B produit deux fragments de 850 nt et 3050 nt. Les plasmides 3 et 4 permettront donc la production de la protéine Myoser. Le gène myoser de souris contrôles et de souris Mdx a été cloné par PCR en utilisant les mêmes amorces 1 et 2 que celles utilisées pour l'amplification de l'adnc. Les fragments amplifiés ont été séquencés par la technique de Sanger avec l'amorce 2. Une partie des autoradiographies des gels de séquençage est donnée dans la figure Déduire la séquence nucléotidique du brin non transcrit de la région séquencée pour le gène Myoser de souris contrôle et de souris Mdx. Orienter cette séquence correctement en indiquant les extrémités 5' et 3'. Souris Contrôle Souris Mdx 5'-ACA GAC GCC CTT CTA TCC AGG CGG GGG-3' 5'- ACA GAC TAA CTT CTA TCC AGG CGG GGG-3' Remarque : beaucoup d'entre vous ont juste donné la séquence lue sur l'autoradiogramme et qui correspond au brin transcrit 9. D'après ces séquences, quelle est l'origine moléculaire la plus vraisemblable du phénotype des souris Mdx. Le codon GCC codant pour une alanine a été transformé en un codon TAA qui est un codon stop. Ce codon stop entraîne un arrêt prématuré de la synthèse protéique. Si on se place sur l'adnc on peut voir que la protéine synthétisée comportera 48 acides aminés en moins soit 5000 Da.