Utilisation de la biopuce ImmunoCAP ISAC pour la détermination "simultanée" des profils de sensibilisation à IgE et IgG

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1 Les profils de sensibilisation moléculaire en IgG : apports et limites Utilisation de la biopuce ImmunoCAP ISAC pour la détermination "simultanée" des profils de sensibilisation à IgE et IgG Dr Pol André Apoil Laboratoire d'immunologie Dr Claire Mailhol Pôle des Voies Respiratoires C.H.U. de Toulouse

2 Contexte & Objectifs de l'étude Expérience du C.H.U. de Toulouse avec l'immunocap ISAC : 200 patients étudiés par an depuis 2010; recueil obligatoire des données cliniques; réunions clinico-biologiques. En se basant sur ces données clinico-biologiques et grâce à la conservation des biopuces après leur utilisation pour déterminer le profil de sensibilisation à IgE, est-il possible de réutiliser ces mêmes biopuces pour étudier les profils à IgG spécifiques? Etude d'environ 200 patients "allergiques et sensibilisés à IgE" et de 50 individus constituant un groupe témoin : patients non sensibilisés à IgE (ISAC "blanc"), présentant des symptomes isolés, non reproductibles, et pour lesquels l'isac a été réalisé pour éliminer une pathologie IgE-médiée.

3 Population Etudiée Mode de recueil des données cliniques Utilisation d'une fiche de prescription et de renseignements cliniques standardisée Etude monocentrique rétrospective : 244 patients ayant été étudiés par ImmunoCAP ISAC au C.H.U. de Toulouse en 2013 & 2014 Indications: exploration des allergies respiratoires et/ou alimentaires (le plus souvent sévères/complexes) Population : Enfants (Hôp. Des Enfants-site de Purpan et adultes (Hôp. Larrey-site de Rangueil) ~200 patients par an depuis 2010 Recueil obligatoire des données cliniques Réunions clinico-biologiques régulières Au total 194 patients avec symptômes allergiques ET sensibilisés à IgE (122 patients entre 5 et 30 ans). Pathologies exclues : 50 patients avec pathologies non IgE-médiée (ISAC "blanc")

4 1 ère incubation : sérum, puis anti-ige monoclonal (alexafluor 532) Détection et quantification des IgG spécifiques 2 ème incubation : anti-igg polyclonal 1:100 (alexafluor 647) Stockage à C à l abri de la lumière avec dessicant mois (suivant le lot de lames) Anti-IgE : Ac. Monoclonal murin (ThermoFisher) Anti-IgG : F'ab') 2 goat, human Fc-specific Signal de Fluorescence rcan f 2 rcan f 5 rphl p 5 rpru p 3 nder p 1 rcan f 1 namb a 1 ngal d 2 rphl p 1 rfel d 1 nart v 1 nole e 1 rbet v 1 rder p 2 ngal d 1 IgE spécifiques (ISU-E) nole e 1 rbet v 1 rder p 2 ngal d 1 rphl p 1 rfel d 1 nart v 1 nder p 1 rcan f 1 ngal d 2 namb a 1 rcan f 2 rcan f 5 rphl p 5 rpru p 3 Exemple de calibration IgE et IgG avec le sérum de contrôle CTR02 pour le lot de lames #AA6 CTR02: mélange de 15 anticorps monoclonaux murins anti-composants (cf.liste) humanisés par un fragment Fc epsilon humain, dans une matrice constituée de sérum humain déplété en IgE (mais contenant de nombreuses spécificités IgG) Signal de Fluorescence brut ngal d 1 nbos d 4 rpla a 3 rtri a 14 nbos d 5 role e 9 nart v 3 rcor a 8 rbla g 2 rhev b 5 ngal d 3 ncup a 1 IgG spécifiques (unités arbitraires 0 100) rbla g 2 rcor a 8 rhev b 5 ngal d 3 ncup a 1 nbos d 5 role e 9 rpla a 3 nart v 3 rtri a 14 nbos d 4 ngal d 1

5 Avantages et limites de la méthode employée... Il s'agit d'une mesure semi-quantitative, en unités arbitraires, des IgG "totales" (IgG 1 + IgG 2 + IgG 3 + IgG 4 ) spécifiques de chacun des 112 composants de l'isac. Lors de l'étude initiale à but diagnostique (profils IgE), les biopuces ont été incubées en présence des sérums non dilués. Le protocole "standard" ThermoFisher d'étude des profils à IgG 4 recommande une dilution au 1:50 des sérums, ceci pour éviter la saturation des signaux de fluorescence. Les biopuces ont été conservées à C pendant une durée prolongée et ce stockage s'est accompagné d'une dégradation modérée et progressive des IgG liées aux composants. Cette dégradation partielle empêche la saturation des signaux de fluorescence. Les lames ISAC conservées à température ambiante pendant 1 à 2 ans peuvent ainsi être étudiées. L'utilisation d'un même sérum de calibration (CTR02) pour tous les lots de lames à permis de compenser cette dégradation liée au stockage, qui était de durée variable suivant les lots (entre 12 et 24 mois). Coût en réactifs de l'étude des profils IgG = 250 HT pour 250 individus...

6 Standardisation des dosages d'igg spécifiques selon les lot de lames Signal de Fluorescence brut Signal de Fluorescence brut Superposition des droites de calibration pour les 15 lots de biopuces étudiés AVANT application du facteur de correction Fluorescence attendue APRES application du facteur de correction Durée de stockage Durée de stockage croissante Lot de lames # Un facteur de correction a été calculé pour chaque lot de lames, basé sur la somme des signaux bruts de fluorescence pour le sérum de calibration CTR02. Ce facteur de correction (variant de 0,12 à 0,83 suivant la durée de stockage des lots de lames) a été ensuite appliqué à toutes les valeurs de fluorescence, pour tous les composants et tous les patients testés avec le lot correspondant. Au total, 15 lots de biopuces ISAC ont pu être exploités pour l'étude des IgG spécifiques. IgG spécifiques (unités arbitraires)

7 Correspondance entre ISAC-IgG et dosages unitaires d'igg? 12 sérums & 4 composants Les "unités arbitraires" d'igg spécifiques mesurées par l'isac ne peuvent être converties en unités pondérales (mga/l = allergen-specific mg/l). Il existe cependant une corrélation significative entre les deux valeurs (r 2 = 0,38, p<0,05) Fraction des IgG spécifiques de nbos d 8 (caséine) qui sont d'isotype IgG 4 IgG spécifiques de nbos d 8 qui ne sont pas des IgG 4 La plus grande partie des IgG spécifiques détectées par l'isac- IgG ne sont pas des IgG 4. La concentration de ces IgG spécifiques peut atteindre des valeurs très élevées (>100 mga/l).

8 Analyse qualitative: Catégorisation des Individus suivant leurs profils IgE et IgG ncup a 1 nder p 1 Pour chaque composant et chaque individu, classement dans l une des 4 catégories définies cidessous : sige<0,3 ISU-E sigg<1 UA sige>0,3 ISU-E sigg<1 UA sige<0,3 ISU-E sigg>1 UA sige>0,3 ISU-E sigg>1 UA IgG (unités arbitraires, UA) 1 UA IgG (unités arbitraires, UA) 0,3 ISU-E IgE (ISU-E) IgG (unités arbitraires, UA) IgG (unités arbitraires, UA) IgE (ISU-E) rbet v 1 rara h 2 IgE (ISU-E) IgE (ISU-E)

9 Analyse qualitative des profils de sensibilisation à IgE et IgG TROPHALLERGENES AEROALLERGENES PAN-ALLERGENES P A T I E N T S A L L E R G I Q U E S Age (years) "ni IgE, ni IgG" "IgE, pas d'igg" "IgG, pas d'ige" "IgE & IgG" 194 individus 50 CONTROLES individus

10 Analyse quantitative des IgG spécifiques pour chaque composant Allergen source Type Allergen component Mean IgG (Allergy) Mean IgG (No Allergy) P Allergiques Non allergiques Peach LTP (food) rpru p < Nut Food njug r < Nut Food njug r < Bermuda Grass pollen ncyn d < Birch PR-10 (tree poll.) rbet v < D. farinae Dust mites rder f < Timothy Grass pollen nphl p < Wheat Food rtri a < Apple PR-10 (food) rmal d < Cypress Tree pollen ncup a < Timothy Grass pollen rphl p < Timothy Grass pollen nphl p < Plane tree LTP (tree poll.) rpla a < Peanut Food nara h < Plane tree Tree pollen npla a < Peanut Food rara h < Mugwort LTP (weed poll.) nart v < D. farinae Dust mites nder f < Cedar Tree pollen ncry j < D. pteron. Dust mites rder p < D. pteron. Dust mites nder p < Analyse par test non-paramétrique de Mann-Whitney comparant les valeurs d'igg spécifiques pour chacun des 112 composants de la biopuce (unités arbitraires UA). Seuls les 21 composants pour lesquels p< 0,0001 sont montrés. H F H F 0 10 ans ans ans > 40 ans Total âge<20/>20 1,90 1,74 1,88 1,30 Sex ratio 0,97 1,00 Ajustement des effectifs en fonction du sexe et de l'âge dans le groupe "allergiques" (n = 124) et dans le groupe de témoins non sensibilisés à IgE (n = 46). Plus 36 autres composants avec des IgG spécifiques plus élevées dans le groupe "allergiques" et p<0,05 Les sujets allergiques ont des concentrations d IgG spécifiques significativement plus élevées que les témoins non allergiques / non sensibilisés à IgE.

11 Spécificité de la réponse à IgG anti-allergènes < < n.s. Chez les sujets allergiques, la présence d IgE dirigées contre un composant s accompagne d une concentration accrue des IgG spécifiques de ce même composant. IgG (unités arbitraires) < n.s A B C A B C A B C rara h 1 rara h 2 nara h 6 A. Individus du groupe "allergiques", sensibilisés contre au moins l un des 4 composants SSP (protéines de stockage) de l arachide Ara h 1 (n=37), Ara h 2 (n=48) ou Ara h 6 (n=45). B. Individus du groupe "allergique", dépourvus de sensibilisation à IgE vis-à-vis des composants SSP de l arachide (n = 68) C. Individus témoins non allergiques, non sensibilisés à IgE vis-à-vis des composants de l ISAC (n=50)

12 Dominance allergénique et type de réponse humorale : Phléole Nombre de patients sensibilisés à IgE pour le composant indiqué, rapporté au nombre d'individus sensibilisés à au moins l'un des composant de la phléole (n=126) Fraction d'individus sensibilisés *** 84% 70% 56% 47% 35% 26% 25% 7% dominance Les allergènes majeurs entrainent plus souvent une réponse à IgE + IgG que les composants mineurs (sauf pour les polcalcines) *** Test de Fisher comparant le nombre de patients sensibilisés à IgE au nombre d'individus sensibilisés à IgE + IgG

13 Dominance allergénique et type de réponse humorale : Arachide Nombre de patients sensibilisés à IgE pour le composant indiqué, rapporté au nombre d'individus sensibilisés à au moins l'un des composant de l'arachide (n=67) Fraction d'individus sensibilisés 54% 52% 51% 33% 30% 15% 5 15 ans : n = 43, sex ratio: 1, ans : N = 24, sex ratio: 0,71 Pour l'arachide, on retrouve aussi une fréquence accrue de sensibilisation combinée à IgE + IgG envers les 2 composants majeurs Ara h 2 et Ara h 6

14 Confrontation des profils à IgG avec la clinique Quelles informations sur la physiopathologie de l'allergie l'étude de ces profils à IgG peut-elle apporter? Existe-il une corrélation entre la présence ou l'absence d'igg spécifiques associées aux IgE spécifiques et la sévérité des symptomes d'allergies? Plus généralement, ces profils de sensibilisation à IgG présentent-ils un intérêt dans le diagnostic des allergies?

15 Corrélation entre taux d'igg spécifiques et sévérité des allergies respiratoires? 54 patients (5-15 ans: n=28/sr=1,8; ans: n=25/sr=0,4) avec rhinite allergique sans asthme, comparés à 40 patients (11-29 ans/sr=0,43), présentant rhinite & asthme allergiques. La somme des sensibilisations à IgE (ISU-E) ou IgG (AU) pour 32 composants allergéniques a été prise en compte pour le calcul. IgE IgG Sensibilité / Spécificité Sensibilité / Spécificité AUC pour le calcul prenant en compte IgE + IgG = 0,59 (normalisées de 0 à 100) Somme des IgE en ISU-E Somme des IgG en UA Phléole + Animaux + Acariens + Pollens d'herbacées + Pollens d'arbres (7 composants) (5 composants) (6 composants) (6 composants) (8 composants) Dans cet exemple où ne peut pas identifier avec certitude les allergènes responsables des symptômes, le dosage des IgG spécifiques apporte moins d informations que le dosage des IgE spécifiques...

16 Corrélation entre IgG et allergie à l'arachide? 44 patients (5-15 ans: n=33/sr=1,54; ans: n=11/sr=1,2) allergiques à l'arachide, comparés à 68 (5-15 ans: n=31/sr=1,38; ans: n=37/sr=0,37) patients sensibilisés, mais asymptomatiques vis-à-vis de l'arachide. IgE an(-ara h 2 (ISU-E) Somme des IgE an(- Ara h (ISU-E) Somme des IgE an(- Ara h (ISU-E) Sensibilité / Spécificité Sensibilité / Spécificité Sensibilité / Spécificité IgG an(-ara h 2 (IgG UA) Somme des IgG an(- Ara h (IgG UA) Somme des IgG an(- Ara h (IgG UA) Sensibilité / Spécificité Sensibilité / Spécificité Sensibilité / Spécificité AUC pour le calcul prenant en compte IgE + IgG (normalisées) = 0,77 Aucun apport du dosage des IgG spécifiques d'ara h 1/2/3/6/8/9 dans le diagnostic de l'allergie à l'arachide...

17 41 patients (5-30 ans) allergiques à l'arachide 69 patients (5-30 ans) allergiques, non symptomatiques vis-à-vis de l'arachide 86% 79% 50% 79% rara h 1 rara h 2 rara h 3 nara h 6 IgG 54% 29% 16% 17% 26% IgE rara h 1 rara h 2 rara h 3 nara h 6 55% 83% 81% 50 individus (1 71 ans) non allergiques, non sensibilisés à IgE L'ensemble de la réponse humorale "antiarachide" à IgG et à IgE ne se fait pas contre les mêmes composants chez les allergiques et chez les sujets asymptomatiques à l'arachide : - Ara h 1 chez les asymptomatiques (IgG) - Ara h 2 / Ara h 6 chez les allergiques (IgE & IgG) 36% 8% 8% 6% rara h 1 rara h 2 rara h 3 nara h 6 Les molécules Ara h 2/h 6 ne sont pas "vues" de la même façon par le système immunitaire chez les sujets allergiques à l'arachide comparés aux non allergiques. Cependant, tous les individus, allergiques ou non, peuvent développer des anticorps (IgG) dirigés contre Ara h 2 et/ou Ara h 6. La production d'ige antiarachide s'accompagne d'une "déviation" de la réponse à IgG vers Ara h 2 et Ara h 6. Hypothèses : (1)- les molécules HLA-II présents chez les individus allergiques à l'arachide présentent plus "efficacement" les peptides dérivés de Ara h 2/h 6 que les allèles du CMH-II présents chez les sujets qui ne développent pas d'ige anti-arachide? (2)- Ara h 2 & Ara h 6 ont-ils des propriétés qui les rendent plus immunogènes chez les individus prédisposés à l'allergie à l'arachide?

18 Commutation isotypique et maturation d'affinité dans la réponse à IgE Direct Peu de mutations somatiques (basse affinité) Indirect Mutations ++ (haute affinité) Basse affinité IgE Haute affinité = risque accru de symptômes VDJ Cµ Cδ Cγ3 Cγ1 Cα1 Cγ2 Cγ4 Cε Cα2 Les deux mécanismes de commutation de classe d'immunoglobuline (directe et indirecte) menant à la synthèse d'ige coexistent chez l'homme IgG 1 IgG 4 IgA2? La présence simultanée d'igg et d'ige spécifiques des mêmes allergènes devrait être associée à la présence d'ige de haute affinité. Dr Pol A. Apoil - C.H.U. de Toulouse

19 Intérêt possible de confronter les profils à IgG et à IgE Ara h IgE + IgG IgE sans IgG 56 patients allergiques à l'arachide (1 29 ans) : 9 patients (16%) n'ont pas développé d'igg anti-ara h 2 et/ou Ara h 6, tout en ayant produit des IgE spécifiques de ces 2 composants majeurs. Quelle est l'évolution clinique de ces patients comparée aux allergiques qui produisent IgE + IgG contre les composants Ara h2 / h 6? Quelle sera leur réponse clinique et biologique à une ITO à l'arachide?

20 EN CONCLUSION (1) La "ré-utilisation" des biopuces ISAC pour déterminer les profils de sensibilisation à IgG est possible, bien que la méthode que nous avons employée puisse être optimisée et améliorée... La mesure des IgG spécifiques que nous avons réalisée est semi-quantitative et n'est pas une mesure de la concentration de ces IgG en mg/l. La corrélation entre la présence d IgG spécifiques anti-composants et l existence de symptômes d allergie est beaucoup plus faible que la corrélation entre symptômes et présence d IgE spécifiques anti-composants. En conséquence, les informations que l'on peut retirer des profils à IgG n'ont actuellement aucun intérêt en terme de bénéfice individuel pour le patient, mais peuvent apporter des données nouvelles sur la physiopathologie de l'allergie. Il reste à caractériser plus précisément, sur le plan de leur clinique et de leur évolution, les patients qui ne produisent PAS d'igg contre certains composants (en particulier pour les composants de l'arachide).

21 CONCLUSION (2) : une précision importante... Le protocole que nous avons utilisé dans cette étude n'est en aucune mesure comparable aux "dosages d'igg anti-aliments" décrits ci-dessous... (lequels sont réalisés par méthode ELISA avec des extraits allergéniques et sont interprétés, sans aucun fondement scientifique, dans un but diagnostique et d'orientation thérapeutique) «Les dosages d IgG anti-aliments ne devraient plus être prescrits en routine. Leur utilisation devrait être réservée à des fins de recherche, dans l état actuel des connaissances médicales.» groupe de travail de Biologie de la SFA Habib Chabane Testing for IgG4 against foods is not recommended as a diagnostic tool: EAACI Task Force Report testing of IgG4 to foods is considered as irrelevant for the laboratory work-up of food allergy or intolerance and should not be performed in case of food-related complaints. Stapel et al. Allergy 2008: 63: AAAAI support of the EAACI Position Paper on IgG4 Serum antibody levels for IgG4 or IgE (or other IgG subclasses) indicate the presence of specific antibody but do not make a diagnosis. The presence of antibody does not indicate disease

22 Remerciements Hôpital des Enfants Pneumologie- Allergologie Dr A. Juchet Dr A. Chabbert-Broué Dr A. Martin-Blondel Hôpital Rangueil Laboratoire d'immunologie Carre E., Lanot T., A. Ribes (internes) J. Zaccariotto (technicienne) Université Paul Sabatier Facultés de Médecine de Toulouse Laboratoire d'immunogénétique Moléculaire Pr A. Blancher Hôpital Larrey Pneumologie & Allergologie Dr C. Schwartz Dr V. Boutchkova Pr A. Didier

23 Merci pour votre attention!