Génotypage et Séquençage. Pierre Mournet

Transcription

1 Génotypage et Séquençage Pierre Mournet

2 Plan Séquençage/Génotypage Classique (usat, Sanger) Séquençage NGS (Next Generation Sequencing) Séquenceur Préparation Pré-NGS Exemple 1 NGS Exemple 2 NGS Génotypage SNP (Single nucléotide polymorphism) Le système Fluidigm Outils pour du haut débit 2

3 Séquenceur capillaire (bas à moyen débit) Capacité à moderniser/remplacer le parc de séquenceurs capillaires installés pour des analyses de génotypage classiques Marqueurs µsat, AFLP Séquences Sanger Séquençage Sanger en soutien au donnée NGS: outil de validation Spécifique à un locus Hautement polymorphe Facile d utilisation Très bonne répétabilité 3

4 Capacités de séquençages capillaires UMR AGAP CIRAD 1 24 cap ABI 3500xl UM II / ISEM PF GenSeq du Labex CeMeb 1 24 cap ABI 3500 xl 1 16 cap ABI 3130 xl UMR AGAP INRA UMT Genovigne 3 16 cap ABI 3130 xl 4

5 Capacités de séquençages capillaires UMR AGAP CIRAD 1 24 cap ABI 3500xl UM II / ISEM PF GenSeq du Labex CeMeb 1 24 cap ABI 3500 xl 1 16 cap ABI 3130 xl Installation d un séquenceur 8 capillaires ABI 3500 en remplacement de 2 séquenceurs ABI 3130xl (2003, 2006) 16 capillaires UMR AGAP INRA 1 8 cap ABI 3500xl UMT Genovigne 1 16 cap ABI 3130 xl Maintien des capacités de séquençages capillaires sur la région Montpelliéraines 5

6 Séquenceur NGS Mise à disposition au sein de l UMR AGAP depuis 2012 d un «personal sequenceur» Miseq Illumina, 20 Millions de séquence/run, fragment de 50 à 600 pb Installation d une deuxième machine Miseq dans le cadre du Projet FEDER, fin 2014/début Pour des projets demandant de plus grandes capacités de séquençages, passage sur séquenceur Hiseq 2000/2500 Illumina ( 16 x 200 millions de séquences/run), en 1 ou 2 x 100 pb. 2 partenaires privilégiés: La plateforme MGX (IGH/Montpellier): La plateforme Genotoul (INRA/Castanet Tolosan) 6

7 Séquenceur NGS Illumina MiSeq Personnal Sequenceur NGS UMR AGAP CIRAD Illumina HiSeq 2500 Sequenceur NGS Montpellier Genomix Illumina MiSeq Personnal Sequenceur NGS UMR AGAP INRA Illumina HiSeq 2500 Sequenceur NGS GeT (Toulouse) 7

8 Application des NGS: préparation des librairies Séquençage, assemblage de génome GBS par réduction enzymatique Séquencage et reséquencage Développement de marqueurs moléculaires Génome: ADN RNAseq Standard et normalisé Caractérisation fonctionnelle de gène/génomique comparative Analyse de l expression des gènes Capture de cibles génomiques Epigénome: Analyse de la régulation des gènes Métagénomique Séquencage ciblé d amplicon Metabarcoding ADN ancien ADN dégradé Small RNA Chipseq MeDIP BS-seq 8

9 Laboratoire Pré-NGS Constructions de librairies avant séquençage selon différents protocoles. Jusqu à présent: Travail artisanal et de mises au point dans nos laboratoires. Prochainement: Organisation d un laboratoire capable d accompagner l augmentation de nos besoins en préparations de librairies NGS (vers le haut débit). Capacité à élaborer tous les types de librairies d ADN/ARN compatibles avec l usage de tous les types de séquenceurs NGS Acquisition de nombreux matériels grâce au projet FEDER afin de répondre à ces objectifs 9

10 Laboratoire Pré-NGS Arcad FEDER Installation d un robot pipeteur Généraliste: 1 tête 96 canaux (200 µl) + 8 canaux indépendants ( µl) Installation d un Bioanalyseur 96 échantillons pour le contrôle des banques avant séquençages et des ADNs/ARNs (matériel en commun avec la DNABank). Installation d un spectrophotomètre/fluorimètre Access Array: Préparation de libraries Amplicon-seq 10

11 48 échantillons Avantage: -Limite le nombre de pipetage -cout de préparation des amplicons reduits/ PCR classique -Pas d étape de normalisation des ADNS -Méthode rapide 48 couples de primers Préparation de 2304 amplicons Si multiplexage avec 10 couples de primers/réactions = amplicons Séquencage sur Personal Genome sequenceur Miseq. 11

12 Laboratoire Pré-NGS Covaris Shearing UM II / ISEM Covaris e220 UMR DIADE IRD Access Array Fluidigm UMR AGAP CIRAD Plusieurs outils Pré- NGS UMR AGAP INRA 12

13 Exemple NGS 2: RNA-seq Arcad SP1 Sorgho Démographie et sélection D. Pot & E. Reclus 13

14 Exemple NGS 1: Re-GBS sur Citrus 110 échantillons Enzyme ApekI 2 plex de 55 code barre Séquencage sur 2 lignes Hiseq Analyse sur: 7795 marqueurs SNPs 10% de données manquantes Profondeur de 5X P. Ollitrault & D. Dambier 14

15 Laboratoire SNP: Biomark Fluidigm (Moyen Débit) Capacité à transformer les marqueurs moléculaires SNP obtenues par NGS Avavantages: Technologie robuste et simple Débit important: 1 puce 96*96 = 24 plaques 384 (9216 points de données) Faible consommation de réactifs et d ADN Technologie compatible avec l ensemble des chimies disponibles Inconvénients: Les puces sont couteuses environ 550 euros (master mix compris) Contrainte sur le format des puces Méthode sensible à la qualité de l ADN 15

16 Laboratoire SNP: Premiers résultats sur le système Biomark Espèce: Hevea brasiliensis Population étudiée : 186 génotypes descendants d un seul croisement 96 SNPs génotypés en 2 runs sur Fluidigm Biomark avec la chimie Kaspar Résultat: 85 SNPs cartographiables R. Rivallan, V. Le Guen & D. Garcia 16

17 Laboratoire SNP: Si vous avez besoin de très haut débit Technologie Infinium Illumina disponible au CNG d Evry (puce de K SNP) 24 échantillons minimum. Technologie Axiom Affymetrix disponible sur la plateforme Gentyane de Clermont-Ferrand (puce de 1500 à SNP). Nb de SNP/puce Achat minimum Cout total Cout par échantillon Prix catalogue Affymetrix Format K 5 x 96 puces jusqu'à 670 K 5 x 96 puces K 32 x 96 puces jusqu'à 670 K 32 x 96 puces Format 384 jusqu'à 34 K 5 x 384 puces

18 Merci