1. Techniques de prélèvement. 2. Méthodes de diagnostic direct. Chapitre 3 Méthodes de diagnostic en virologie Méthodes de diagnostic rapide

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1 Chapitre 3 Méthodes de diagnostic en virologie 1. Techniques de prélèvement Cf. fiche «Phase pré-analytique des analyses de virologie médicale». 2. Méthodes de diagnostic direct 2.1. Méthodes de diagnostic rapide La détection directe d antigènes viraux dans les produits pathologiques présente l avantage d être relativement simple et rapide à mettre en œuvre. Elle permet la mise en route de mesures thérapeutiques immédiates, mais ne s applique qu aux infections où des quantités importantes de virus sont produites. Les virus sont riches en constituants protéiques ou glycoprotéiques pouvant faire l objet d une reconnaissance immune par des anticorps spécifiques. Ces anticorps constituent des outils diagnostiques précieux ; il peut s agir : - d anticorps polyclonaux d origine humaine (produits à l occasion d infections naturelles) ou le plus souvent animale (obtenus par immunisation expérimentale) ; - d anticorps monoclonaux (d origine habituellement murine) dont le grand intérêt réside dans la précision de l épitope reconnu. Il peut être intéressant d utiliser des anticorps dirigés contre des antigènes de groupe capables de reconnaître plusieurs virus appartenant à un même genre (adénovirus ou entérovirus) ou au contraire de cibler un épitope spécifique de type (différenciation entre virus herpes simplex types 1 et 2). La méthode consiste à visualiser le complexe antigène-anticorps ; pour ce faire de nombreuses techniques sont disponibles : - agglutination de particules sensibilisées (hématies, latex, particules de gélatine), - fluorochromes, - marqueurs enzymatiques (technique ELISA et ses très nombreuses variantes). Le système de marquage peut être lié directement à l anticorps primaire ou, le plus souvent, fixé sur un anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines de l espèce animale chez laquelle a été produit l anticorps primaire. Avantages Inconvénients Facilité de mise en œuvre ; Faible sensibilité ; Rapidité d exécution. Coût relativement élevé ; Nombre limité de virus recherchés. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 1

2 Principales applications des techniques de détection directe d'antigènes viraux dans les prélèvements pathologiques en virologie médicale : Exemple 1 : PASTOREX ROTAVIRUS (Bio-Rad) Les Rotavirus sont reconnus comme les agents les plus fréquemment rencontrés lors des gastro-entérites aigües. Au début et durant la phase aiguë de la maladie, des particules virales de Rotavirus sont excrétées dans les selles en quantité importante (10 8 particules virales par gramme de selles). Des particules de latex, sensibilisées avec la fraction immunoglobulinique (IgG) d un antisérum de lapin anti- Rotavirus, sont agglutinées en présence de Rotavirus présents dans les selles. Des particules de latex sensibilisées avec une fraction immunoglobulinique (IgG) d un sérum de lapin normal sert de latex de contrôle négatif. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 2

3 Exemple 2 : PATHFINDER HERPES SIMPLEX VIRUS (Bio-Rad) Le système de détection directe des antigènes du virus herpes simplex (HSV) de types 1 et 2 Pathfinder est un test par fluorescence directe permettant d'identifier et de typer le virus herpes simplex dans des échantillons cliniques directs et des isolats de culture cellulaire. Le système de détection directe des antigènes du virus herpes simplex (HSV) de types 1 et 2 utilise quatre anticorps monoclonaux conjugués à la fluorescéine pour identifier et typer le HSV dans les échantillons cliniques directs et les isolats de culture cellulaire. L'identification et le typage présomptifs du HSV sont possibles dans l'heure qui suit la réception d'un échantillon clinique. Déposés dans des puits séparés d'une lame contenant l échantillon, les anticorps monoclonaux dirigés contre le HSV-1 et le HSV-2 réagissent avec les antigènes viraux dans les cellules infectées. Une étape de lavage élimine les anticorps non liés. Au microscope à fluorescence, les cellules infectées par le HSV présentent une fluorescence vert pomme caractéristique sur un fond contre-coloré en rouge. Exemple 3 : PATHFINDERTM RSV (Bio-Rad) PATHFINDER TM RSV est un test immunoenzymatique (ELISA) qualitatif pour la détection directe du virus respiratoire syncytial (RSV) dans les liquides de lavage ou d aspiration nasale (le virus respiratoire syncytial est une des causes principales de bronchiolite et de pneumonie chez le nourrisson et l enfant). Un diagnostic rapide d une infection à RSV a d autant plus d importance aujourd hui que l on a mis au point un traitement efficace. Le test RSV utilise des anticorps polyclonaux et monoclonaux pour la détection du RSV directement dans des échantillons de patients. Des résultats qualitatifs sont disponibles en 90 minutes après le début du dosage. Cette méthode d analyse représente une alternative fiable par rapport aux cultures cellulaires qui nécessitent beaucoup de temps. Les antigènes RSV présents dans l échantillon se fixent aux anticorps polyclonaux anti-rsv situés au fond du tube. Les anticorps monoclonaux conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) dirigés contre le RSV se fixent à l antigène. Une étape de lavage permet l élimination de l échantillon et du conjugué non fixés. Le substrat de la peroxydase ajouté dans le tube entraînera une coloration bleue si des anticorps conjugués à la HRP sont présents. Un examen par spectrophotométrie de l échantillon détermine la présence ou l absence de RSV. Un échantillon présentant une coloration bleue ou dont la valeur d absorbance est supérieure ou égale à la Valeur Seuil est positif en antigène RSV. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 3

4 2.2. Méthodes de culture des virus Parasites intracellulaires obligatoires, les virus ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes. L isolement de virus à partir des prélèvements biologiques a représenté pendant de nombreuses années, le seul moyen de diagnostic direct des infections virales. Trois systèmes sont susceptibles de permettre la réplication des virus : l animal de laboratoire, l œuf de poule embryonné les cellules en culture (seul système utilisé en pratique courante) in vivo : inoculation à l animal et ovoculture Le recours à l animal de laboratoire ou à l œuf de poule embryonné est devenu exceptionnel, même si ces procédés sont encore employés pour l isolement de certains virus : - souriceaux nouveau-nés pour les coxsackievirus A ; Les coxsackie A donnent des «paralysies» flasques et les coxsackie B donnent des paralysies par nécrose cérébrale, cela chez les souriceaux inoculés à la naissance. - œufs de poule embryonnés pour les virus de la grippe. Figure in vitro : en culture cellulaire L inoculation aux cultures cellulaires est le procédé le plus souvent utilisé pour l isolement des virus. Elle doit se faire dans un environnement bien équipé qui permet le respect des règles de sécurité vis-à-vis du risque infectieux, lequel peut nécessiter un confinement strict des activités de culture virale dans un laboratoire adapté de haute sécurité. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 4

5 La plupart des cellules en culture doivent adhérer à un support (verre neutre ou plastique spécialement traité) pour survivre et proliférer. D autres à l inverse se multiplient en suspension. C est le cas des cellules lymphoblastoïdes et de certaines cellules malignes. Les milieux de culture doivent satisfaire aux exigences nutritionnelles des cellules : eau, sels minéraux, glucose, acides aminés, vitamines constituent le milieu de base (milieu de Eagle) auquel sont ajoutés des facteurs de croissance apportés par du sérum animal (de veau le plus souvent), des antibiotiques, éventuellement des antifongiques, une substance tampon (bicarbonate de sodium, TRIS ou HEPES) permettant de contrôler le ph des cultures, et du rouge de phénol comme indicateur de ph. Dans la mesure où il n existe pas un type cellulaire permissif à tous les virus cultivables, deux catégories de cellules sont habituellement entretenues dans les laboratoires de virologie : - les cultures de cellules issues de tissus normaux (cultures primaires et secondaires) ; - les lignées continues. Les cultures primaires et secondaires proviennent de tissus normaux d origine humaine ou animale, prélevés sur des organismes adultes ou embryonnaires. Les cellules, séparées par action de la trypsine et placées dans le milieu de culture, se fixent sur la paroi du récipient et se multiplient jusqu à former un tapis continu, fait d une seule couche cellulaire. Arrivées à confluence, elles cessent de se multiplier par inhibition de contact. Cette culture, dite primaire peut, elle aussi, être dissociée par la trypsine et donner naissance à de nouvelles cultures dites secondaires qui peuvent à leur tour être entretenues par «passages». Le nombre de passages en série n est pas illimité : deux à trois seulement pour les cellules épithélioïdes, une cinquantaine au maximum pour les cellules fibroblastiques embryonnaires. Les lignées continues, caractérisées par leur capacité de prolifération infinie, proviennent soit de tumeurs malignes (exemple : cellules HeLa issues d un carcinome du col utérin) soit de la transformation spontanée ou viroinduite de cultures primaires ou secondaires (exemple : cellules Vero ou MK2 qui dérivent de cellules de rein de singe). Le nombre de chromosomes des lignées continues est variable (lignées cellulaires hétéroploïdes). Leur croissance est souvent plus rapide que celle des cellules diploïdes et leur nombre de passage théoriquement illimité. Elles doivent être congelées à un nombre de passages donné et le stock régulièrement reconstitué. La congélation des cellules en azote liquide doit être progressive en présence de diméthylsulfoxyde (DMSO). La décongélation, en revanche, doit être rapide. Principales cellules utilisées en virologie médicale : TS2 ABM Cours de microbiologie Page 5

6 2.3. Mise en évidence des effets cytopathogènes Le choix des cultures cellulaires dépend du virus recherché. C est ainsi que le cytomégalovirus est isolé uniquement sur fibroblastes humains diploïdes alors que le virus herpes simplex peut l être sur de nombreux types cellulaires. Les cellules sont examinées tous les deux ou trois jours au microscope optique inversé. Du fait de leur multiplication, certains virus induisent des modifications morphologiques caractéristiques des cellules infectées appelées effet cytopathogène (ECP), visibles soit à l état frais (arrondissement ou rétraction des cellules, foyers de lyse) soit après fixation et coloration des cellules mises en culture sur des lamelles (inclusions intranucléaires ou cytoplasmiques selon le site de multiplication du virus). Cet ECP est souvent évocateur d un virus ou d une famille de virus. Le délai d apparition de l ECP dépend du titre infectieux de l inoculum et du cycle de multiplication du virus. Il peut varier de deux jours à six semaines. L identification précise fait appel à des techniques immunologiques (inhibition du pouvoir infectieux par neutralisation de l ECP, test d immunofluorescence ou immunoenzymatique, inhibition de l hémagglutination) utilisant des anticorps spécifiques, monoclonaux de préférence, voire des techniques de virologie moléculaire. Des techniques de cultures rapides ont été développées pour certains virus (CMV, HSV, VZV, Adénovirus, Entérovirus). Elles reposent sur la centrifugation de l inoculum sur des cellules sensibles et la détection, avant que n apparaisse l ECP, d antigènes viraux précoces à l aide d anticorps monoclonaux spécifiques de ces antigènes (par exemple, détection de l antigène p24 pour HIV-1). Elles permettent de réaliser plus rapidement la détection et l identification du virus. La multiplication virale peut également être détectée par recherche d une activité transcriptase réverse pour les rétrovirus. Figure 2 TS2 ABM Cours de microbiologie Page 6

7 2.4. Détection des ADN ou ARN viraux Les techniques de virologie moléculaire sont destinées à mettre en évidence les acides nucléiques des virus. Elles reposent sur la capacité d'une séquence monocaténaire d'acide nucléique cible (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec sa séquence complémentaire dans des conditions définies (hybridation moléculaire). Un traitement adéquat du prélèvement est nécessaire pour extraire l acide nucléique cible et pour le dénaturer (le rendre monocaténaire). Cette cible peut alors être détectée par des techniques d'hybridation simple. La sensibilité de ces techniques peut être accrue par amplification, soit amplification génique, soit amplification post-hybridation Hybridation directe C est une méthode simple. L'hybridation avec une sonde complémentaire est réalisée dans des conditions définies (température, ph ). La révélation du test est effectuée après immobilisation des hybrides et élimination des éléments non-réactifs. L'hybridation en milieu liquide est effectuée directement sur une aliquote du milieu d'extraction, en tubes ou en cupules de plaques de microtitration. La technique en milieu liquide est proposée pour la détection et/ou la quantification des HPV, HBV, HCV, CMV. Dans l'hybridation in situ (HIS), la sonde marquée est mise en contact avec la coupe histologique. Cette technique permet de visualiser la présence du virus recherché dans son environnement cellulaire. Ses principales applications sont la mise en évidence des HPV sur tissu génital, de l'ebv dans les lymphocytes, des HBV et CMV dans le tissu hépatique L hybridation sur membrane peut être réalisée directement (dot-blot) ou après électrophorèse des acides nucléiques en gel d'agarose, puis transfert sur un film de nylon avant adjonction de la sonde (Southern-blot). En règle générale, l'hybridation directe manque de sensibilité. Il est par conséquent souvent nécessaire de lui adjoindre une étape d'amplification : - soit en multipliant au départ la séquence cible (amplification du génome = PCR) ; - soit en accroissant l'intensité du signal de détection. La PCR (amplification en chaîne par polymérase) est la technique la plus répandue. Elle permet la détection de cibles d ADN après une étape d amplification réalisée grâce à une ADN polymérase. thermorésistante (Taq-polymérase). La détection des ARN est également possible après transcription préalable de l'arn en ADN complémentaire par une transcriptase réverse (RT-PCR) Microscopie électronique La microscopie électronique (ME) est un outil précieux en virologie puisqu elle permet de visualiser les virus, de les quantifier et de vérifier la pureté et la qualité d une préparation virale. Cependant les applications de la ME au diagnostic ont disparu progressivement avec les progrès de l immunologie et de la biologie moléculaire. L examen en ME d un prélèvement par la méthode de coloration négative nécessite un personnel formé. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 7

8 VIROLOGIE La «coloration» du prélèvement utilise le plus souvent des sels d acide phosphotungstique ou des sels d acétate d uranyle. La ME peut être mise en œuvre sur tout produit pathologique contenant une grande quantité de virus (parvovirus B19 dans le plasma au cours de la primo-infection par exemple). La mise en évidence de la structure virale permet de faire un diagnostic de groupe (Herpesviridae par exemple) sans qu il soit possible d aller plus loin dans l identification (pas de distinction possible entre virus herpes simplex et varicelle-zona par exemple).enfin, la ME constitue un outil précieux pour caractériser un nouveau virus. Figure 3 3. Méthodes de diagnostic indirect La sérologie représente toujours un outil de diagnostic de nombreuses infections virales (infection par le HIV, hépatites, mononucléose infectieuse, rubéole, rougeole ). Le diagnostic sérologique consiste à rechercher des anticorps (Ac) synthétisés par l hôte en réponse à une infection virale aiguë ou persistante. Les techniques sérologiques sont basées sur le principe de la spécificité de la réaction antigène anticorps, et utilisent des antigènes viraux de référence sous différentes formes (virus entier purifié, protéine virale native ou recombinante). Leur mise en œuvre repose sur des artifices permettant de visualiser la formation des complexes immuns. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 8

9 Les Ac sont habituellement recherchés dans le sérum, plus rarement dans le plasma ou dans d autres liquides biologiques (LCR, liquide articulaire ). Le sang, prélevé de préférence sur tube sec, doit être centrifugé. L utilisation de certains anticoagulants peut perturber les résultats. Le résultat d une sérologie peut être qualitatif ou quantitatif grâce à la détermination du titre d Ac en dilutions limites. Le titre est défini comme l inverse de la plus forte dilution de sérum donnant une réaction positive Techniques immunoenzymatiques (ELISA) Le sérum à tester est mis en contact avec un support solide (microplaque de titration) sensibilisé par l'antigène viral vis-à-vis duquel est effectuée la sérologie. Après incubation et lavage, le complexe immun ainsi immobilisé est révélé par l addition d Ac anti-immunoglobuline humaine (anti-igg, -IgM, - IgA ou -Ig totales), appelé conjugué, qui est couplé à un système de révélation de nature enzymatique (enzyme immuno assay = EIA ou enzyme linked immunosorbent assay = ELISA). Exemple : PLATELIA EBV-EA-D IgG (Bio-Rad) Ce coffret est destiné à la recherche qualitative des anticorps IgG dirigés contre l'antigène précoce diffus du virus d'epstein-barr (EA-D : Early Antigen Diffused component) dans le sérum. Ce test se base sur la technologie ELISA et utilise des antigènes EBV-EA recombinant fixés sur la phase solide. Lors de la 1ère étape de la réaction, ces antigènes, fixés au fond des puits de la microplaque, sont mis en contact avec le sérum du patient. Les anticorps spécifiques de ces antigènes, s'ils sont présents, se lient pour former des complexes antigène-anticorps. A la fin de l'incubation, l'excès d'anticorps et les protéines du sérum sont éliminés par les lavages. Lors de la 2ème étape de la réaction, le conjugué, des anti-igg humaine de chèvre marquées à la peroxydase de raifort, est ajouté et se lie spécifiquement aux complexes anticorps-antigènes présents. A la fin de l'incubation, le conjugué est éliminé par les lavages. L'addition de substrat tétraméthylbenzidine (TMB) fait apparaître une coloration bleue si des anticorps spécifiques aux antigènes EBV-EA-D sont présents. Quand la réaction est arrêtée par une solution d'acide (H 2 SO 4 1N), le contenu du puits vire au jaune. L'intensité de cette couleur, proportionnelle à la concentration d'anticorps dans le sérum, peut être lue sur un spectrophotomètre approprié ou sur un lecteur de microplaques ELISA. TS2 ABM Cours de microbiologie Page 9

10 3.2. Immunofluorescence indirecte (IFI) Le principe général est proche de celui des techniques ELISA. Le support sensibilisé est constitué de cellules infectées fixées sur une lame porte-objet. Le réactif utilisé pour reconnaître les Ac du patient fixés sur l antigène est un immun-sérum anti-globulines humaines (totales ou spécifiques de classe) conjugué à un fluorochrome. La lecture est effectuée en microscopie optique à fluorescence Techniques radio-immunologiques (RIA) Le principe général est également très proche de celui des techniques ELISA, le deuxième anticorps étant couplé ici à un radio-isotope. La détection des immuns complexes marqués est réalisée grâce à un compteur gamma. Du fait de la difficulté de leur exploitation, les techniques RIA sont de moins en moins utilisées dans les laboratoires de virologie Séroneutralisation Les Ac présents dans le sérum à tester peuvent inhiber les premiers stades (adsorption, pénétration) de la multiplication du virus test dans des cellules en culture et donc le développement de l effet cytopathogène (ECP), visible au microscope optique, dont il est responsable. La réalisation de la séroneutralisation est laborieuse car elle nécessite un laboratoire de culture cellulaire. Elle ne s applique qu aux virus induisant un ECP d apparition rapide (entérovirus, virus herpes simplex). Elle reste la technique de référence pour mesurer l immunité anti-poliomyélitique Inhibition de l hémagglutination Certains virus (de la rubéole, de la grippe ) comprennent à leur surface une hémagglutinine capable d agglutiner spécifiquement les hématies de certaines espèces animales (cobayes, poussins nouveaunés ). Les Ac du sérum à tester peuvent inhiber, par encombrement stérique, l interaction entre l hémagglutinine virale et le globule rouge et donc la formation d un agglutinat visible à l œil nu. Figure 4 TS2 ABM Cours de microbiologie Page 10