3 ème année BCG / LMD TD N 1

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1 TD N 1 Soit le brin d ADN monocaténaire : 5 -TACGCCTAGCTTACGCAT-3 - Combien y a-t-il de liaisons phosphodiester dans le brin bicaténaire? - Combien y a-t-il de liaisons hydrogène dans le brin bicaténaire? Quel serait l effet sur la réplication de l ADN de mutations abolissant les activités enzymatiques suivantes de l ADN polymérase I? a. l activité exonucléasique de 3 vers 5 b. l activité exonucléasique de 5 vers 3 c. l activité polymérase de 5 vers 3 Exercice 03 : Un élément transposable génère des répétitions directes de 4pb de part et d autre de son point d insertion. - Donnez la séquence qui sera trouvée de part et d autre de l élément s il s insère à la position indiquée dans la séquence suivante : Elément transposable 5 -ATTCGAACTGACCGATCA-3 Exercice 04 : Le brin matrice d un ADN bactérien contient la séquence de bases suivante : 5 -AGGTTTAACGTGCAT-3 1- Quels sont les acides aminés codés par cette séquence en utilisant la grille du code génétique? Suite à une mutation qui touche le 4 ème nucléotide dans l ADN matrice et qui n aura aucun effet sur la protéine produite. 2- Indiquez le type de mutation dans l ADN?

2 TD N 2 Exercice 01: Sachant qu une enzyme de restriction est utilisée en excès de 5 fois pour digérer un génome eucaryote. Combien d'unités de cette enzyme seront-elles nécessaires pour digérer 25 échantillons de ce génome tout en sachant que 1 unité enzymatique peut digérer 1µg d ADN dans des conditions adéquates (temps et température)? (Chaque échantillon comprenant de l'ordre de 10 μg d ADN) Quelle est la fréquence statistique des sites de restriction suivant : 1) AGCT pour l enzyme AluI 2) GAATTC pour l enzyme EcoRI 3) GCGGCCGC pour l enzyme NotI Dans un gène de paires de bases, combien de sites pour chacune des trois enzymes mentionnés ci-dessus doit-on s attendre à trouver? Exercice 03: Le fragment d ADN double brin d une cellule de souris a été isolé sur gradient de CsCl puis sa concentration en C est déterminée à 30% 1. Déterminez les proportions des bases T, A et G 2. Pourrait-on prévoir les résultats de la même manière si l ADN était plutôt monobrin 3. Déterminer la taille moyenne des fragments qui peuvent être générés par HaeIII à partir de cet ADN double brin 4. Quelle serait la taille des fragments générés si le pourcentage de chacune des bases d ADN était identique? 5. Indiquez le type de fragments générés par HaeIII. Site de restriction HaeIII : CC/GG

3 TD N 3 Un fragment d ADN linéaire est coupé d une part par Hind III, d autre part par Sma I, puis conjointement par les deux enzymes. Les fragments obtenus sont les suivants : Hind III : 2.5 kb et 5.0 kb Sma I : 2.0 kb et 5.5 kb Hind III + Sma I : 2.5 kb, 2.0 kb et 3.0 kb a) dessinez la carte de restriction. b) le mélange des fragments produits par la combinaison des deux enzymes est ensuite digéré par l enzyme EcoRI, ce qui fait disparaître le fragment de 3Kb et fait apparaître une bande colorée correspondant à un fragment de 1.5 kb. Indiquez le site de clivage d EcoRI sur la carte de restriction. Un gène de 10 Kilobases (K b) a subi une mutation au niveau d un seul nucléotide : remplacement d une cytosine par une guanine. On cherche à identifier la mutation en soumettant le gène normal et le gène muté à l action d une série d endonucléases de restriction (étudiées indépendamment). Après électrophorèse en gel d agarose, on obtient l es résultats suivants exprimés en Kb. Enzymes utilisées Spécificité Gène normal Gène muté EcoR I Bgl II Pst I Sae I GAATTC AGATCT CTGCAG GAGCTC a) quelles sont vos conclusions en ce qui concerne l effet de chaque enzyme sur chaque gène? b) à la lumière de ces conclusions, reconstituez une séquence de 9 nucléotides en précisant le siège de la mutation.

4 TD N 4 On dispose d un fragment d ADN de 40Kb et on connaît les emplacements de deux sites de restriction X et Y. X * 8Kb 32Kb Y Y * 18Kb 7Kb 15Kb 1) Placer sur un schéma représentant une plaque d électrophorèse les fragments produits respectivement par : - L enzyme X seule - L enzyme Y seule - Les deux enzymes (X + Y). L extrémité 5 d un des deux brins du fragment d ADN a été marquée (*) 2) Comparer les fractions issues de l action enzymatique X et X + Y. En bilan de cette analyse, donner la liste des fragments produits par l action de X qui ne sont pas recoupés par Y et ceux qui sont produits par X et sont recoupés par Y. 3) En comparant cette fois les fractions issues de l action enzymatique Y et X + Y, donner la liste des fragments produits par Y qui ne sont pas recoupés par X et ceux qui sont produits par Y et sont recoupés par X.

5 Soit un ADN F, hydrolysé séparément par chacune des 2 enzymes A et B. Les produits obtenus sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose, la taille des fragments de restriction est déterminée grâce à un marqueur de taille M.x Chaque fragment obtenu lors de la 1 ère digestion incomplète, est isolé et hydrolysé : - Avec A pour les fragments résultants de la digestion de F par B, - Avec B pour les fragments résultants de la digestion de F par A, - Parallèlement, on réalise une digestion double de l ADN entre F par les 2 enzymes A et B - Proposer une carte de restriction du fragment F de taille 5000 pb.

6 TD N 5 Le tableau suivant donne la liste d un certain nombre de sites de restriction distincts. Lesquels d entres eux donneront naissance, après digestion, à un site d association entre extrémités cohésives semblables à celui de BamHI? Quelle sera la conséquence de ce type de constatation lors du processus d insertion? Sites de reconnaissance de plusieurs enzymes de restriction : BamHI G/GATCC Bgl II A/GATCT EcoRI G/AATTC HindIII A/AGCTT XmaI C/CCGGG MspI et HpaII sont deux endonucléases qui clivent le même motif palindromique CC/GG. Il est par ailleurs démontré que la méthylation des cytosines qui précèdent les guanines protège les sites CC/GG de l attaque de HpaII et non celle de MspI. 1/ Comment appelle-t-on les enzymes HpaII et MspI? L étude de deux fragments d ADN (A) et (B) isolés à partir de deux tissus différents d un même individu, est réalisée à l aide de ces deux enzymes. L électrophorégramme ci-après est obtenu après coloration au BET des sous fragments de digestion des deux ADN, préalablement séparés par électrophorèse.

7 ADN (A) ADN (A) + Hpa II + Hpa II ADN (A) + Msp I + Msp I Marqueur de taille 10Kb / Que peut-on dire des ADN A et B? Justifiez votre réponse. 3/ Quelle signification physiologique peut revêtir le constat fait à la question 2? En vue de cartographier les fragments d ADN A et B, ils sont marqués avec le (y 32 p) ATP, puis digérés par les enzymes de restriction. L autoradiogramme obtenu est présenté ci-dessous : ADN (A) ADN (A) + Hpa II + Hpa II ADN (A) + Msp I + Msp I Marqueur de taille - 10Kb / Donnez la cartographie des ADN (A) et (B).

8 TD N 6 Proposez par un schéma une stratégie d insertion d un ADNc double brin au site PstI situé sur le gène de la résistance à l ampicilline de pbr322 en utilisant les polydg-polydc la méthode des séquences homopolymériques complémentaires. 1/ Pourquoi est-il intéressant d utiliser les homoplymères dg-dc? 2/ Comment opère-t-on pour libérer ultérieurement la séquence insérée de PBR322? 3/ En quoi l insertion au site PstI est-elle particulièrement utile? (Site PstI : CTGCA/G) Proposez par un schéma une stratégie d insertion d un ADNc double brin au site HindIII d un plasmide quelconque par la méthode des adaptateurs. HindIII : A/AGCTT Exercice 03 Un fragment de restriction d ADN de lapin coupé par l enzyme Kpn mesure 5100pb et contient le gène de la β-globine. Par hybridation après transfert avec une sonde β-globine on démontre qu après digestion par EcoRI de ce fragment, deux sous fragments (de 2500 et de 800pb) s hybrident avec cette sonde, alors qu à la suite de sa digestion par BamHI, deux autres sous fragments radioactifs (de 1900 et de 3000pb) sont produits. Sachant qu au niveau de l ADN complémentaire du messager de la β-globine les deux premiers sites BamHI et EcoRI sont distants de 76 pb. - Montrer que la comparaison des cartes de restriction des deux clones permet d établir l existence d un intron dans la séquence de ce gène et de mesurer sa longueur.

9 TD N 7 Un plasmide pbr322 résistant à la kanamycine et à l ampicilline est coupé avec l enzyme PstI, enzyme coupant dans le gène de résistance à l ampicilline. L ADN plasmidique est ligaturé avec les produits de digestion de l ADN de Drosophile par PstI, puis utilisé pour transformer E. coli. a) quel est le phénotype de la souche d E.coli utilisé dans cette expérience? b) quel antibiotique, mettrez-vous dans le milieu pour vous assurer que les colonies ont un plasmide? c) quels phénotypes de résistance aux antibiotiques trouvera-t-on sur la boite? d) quels phénotypes auront les colonies contenant de l ADN de Drosophile? Comment appelle-t-on ces colonies et comment les sélectionner? Si des colonies individuelles de la boite en (c) sont cultivées et si leur ADN est extrait, quel profil observez-vous après coupure par PstI et coloration du gel d électrophorèse au BET? Afin de cloner un segment d ADN linéaire double brin dans le plasmide puc18, on traite de l ADN à cloner avec les deux enzymes de restriction EcoRI et HindIII. Les plasmides recombinants sont incubés en présence d une souche E.coli AMP S LacZ -. Les bactéries sont ensuite cultivées sur une gélose contenant de l ampicilline et de l IPTG et du X-gal, substrat incolore devenant bleu après hydrolyse par la -galactosidase. Les résultats de ces expériences sont consignés dans le tableau suivant : Enzyme utilisée Type de colonie Taille de l ADN plasmidique en Kpb A : bleue 2,69 EcoRI B : blanche 3,05 C : blanche 3,28 A : bleue 2,69 HindIII B : blanche 2,92 C : blanche 2,81 D : blanche 3,29 1. Quel est le rôle de l ampicilline au cours de ces expériences? 2. A quoi correspond une colonie bleue? Une colonie blanche? 3. Déterminer la taille de l ADN inséré dans ce plasmide. 4. Etablir la carte de restriction de l ADN inséré.

10 Exercice 03 : On dispose de l ADNc (ADN complémentaire) de l insuline humaine, du plasmide pbr322, de bactéries hôtes sensibles à l ampicilline (AMP) et à la tétracycline (TET) ainsi que deux enzymes de restriction : PstI et BamHI. A la fin de cette expérience, nous obtenons trois types de clones bactériens dont les caractéristiques sont regroupées dans le tableau suivant : Clone Milieu de culture + TET Milieu de culture + AMP Milieu de culture Sans antibiotique + : croissance bactérienne I II III : absence de croissance bactérienne 1/ Donner les principales étapes de cette expérience? 2/ Interpréter les résultats regroupés dans ce tableau en précisant le clone positif? 3/ Quels sont les avantages de la synthèse de l insuline par génie génétique?

11 TD N 8 Exercice : Un plasmide de 4000pb a été digéré par EcoRI (E), BamHI (B) et HindIII (H). Les produits de la digestion ont ensuite été séparés par électrophorèse en gel d agarose et la taille (en pb) des différents fragments obtenus a été estimée comme suit : E : 4000, B : 2500 et 1500, H : 2600 et 1400, EB : 1900, 1500 et 600, EH : 1500, 1400 et 1100, BH : 2100, 1000, 500 et 400. Etablissez la carte de restriction de ce plasmide. Ce plasmide porte les gènes de résistance à la tétracycline (TET R ) et à l ampicilline (AMP R ). On désire maintenant cloner le fragment d ADN X. Dans ce but, l ADN X est coupé par EcoRI. Le mélange de ligation est utilisé pour transformer des bactéries compétentes d Eschérichia coli et les produits de transformation sont dilués et étalés sur différents milieux sélectifs contenant de l ampicilline (AMP), de la tétracycline (TET) et/ou de la kanamycine (KAN). Deux clones sont sélectionnés. Les résultats sont portés dans le tableau suivant : Milieu Clone 1 Clone 2 Sans antibiotique AMP TET KAN TET + AMP AMP + KAN TET + KAN AMP + TET + KAN Quelles conclusions pouvez-vous tirer de ces résultats?