Chapitre3 Clonage et expression hétérologue Vecteurs et cellules hôtes

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1 Chapitre3 Clonage et expression hétérologue Vecteurs et cellules hôtes Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf - Eléments dans la construction d un ADN recombinant - ADN à cloner = «insert» N importe quel fragment d ADN db peut être cloné et amplifié dans un système bactérien : ADNc, fragment ADN génomique, produits de PCR, fragment de restriction En fonction de la taille du fragment, la technique de clonage choisie et du but recherchée on définira le vecteur et la cellule hôte. Vecteurs Il existe plusieurs méthodes pour faire entrer un fragment d ADN dans une cellule : entré par l intermédiaire d un plasmide, d un phage ou d un virus, entrée d ADN nu. Quel est le devenir de cet ADN? Il peut être reconnu par la machinerie cellulaire s il porte des signaux de reconnaissances. Si signaux réplications -- réplication Si signaux transcription/ traduction -> traduction transcription 1 les cellules hôtes utilisées en génie génétique - procaryote : E coli (DHSα, BL21, ) - eucaryote : levure : Saccharomyces, pichia pastoris cellule d insecte sf9 cellule CHO : chinese hamster ovarian cells HEK 293 : human embryonic kidney cells Œuf fécondé Cellule souche embryonnaire ES Pour le clonage : E Coli Pour l expression : l un ou l autre des types cellulaires en fonction de la protéine et de l utilisation de la protéine. Remarque : certaines protéines sont produites à partir d animaux transgéniques : lait de vache, chèvre Avantage et inconvénient des différents types cellulaire : Cf chap V

2 2 Vecteurs 2.1 Rôles Permettent de flanquer l ADN de séquence de signalisation qui seront reconnue par les facteurs cellulaires. Si l on souhaite recopier (multiplier) l ADN vecteur de clonage Si l on souhaite produire une protéine vecteur d expression Si les signaux sont reconnus par la machinerie procaryote vecteur procaryote Si les signaux sont reconnus par la machinerie eucaryote vecteur eucaryote 2.2 Les vecteurs procaryotes Généralités et quelques exemples de vecteurs Les premiers vecteurs utilisés étaient des phages puis des plasmides Vecteurs couramment utilisés : plasmide, phage, cosmide (hybride phage/plasmide), BACS (bacterial artificial chromosomes) Caractéristiques essentielles pour le clonage et l expression - origine de réplication - site de coupure par les enzymes de restriction - repérage facile des bactéries transformées Souvent présence de marqueurs conférant un phénotype nouveau à la bactérie 3 Plasmides 3.1 Généralités Plasmide : ADN circulaire extra chromosomique. - plasmide conjugatif permettant l échange d information entre bactérie : facteurs F (94Kb) - résistance aux antibio : facteur R - résistance aux métaux lourds : facteur R Il existe des bases de données des plasmides présents à l état naturel dans différentes bactéries. Les caractéristiques pour qu un plasmide constitue un bon vecteur de clonage : taille, site de restriction (varié mais unique), le nombre de copie / cellule, présence de marqueur génétique. Les plasmides utilisé comme vecteur en génie génétique sont des hybrides.

3 3.2 Exemple de plasmide Plasmide de clonage Plasmide pbr 322 Boliver et rodriguez, pb Amp R tet R pmb9 cole1 Amp : inhibe la synthèse de la paroi bactérienne Amp R : synthèse d une enzyme hydrolysant le cycle bêta lactame qui dégrade amp Tet : liaison a la sous unités 30s Tet R : empêche entrée de l antibiotique Carte restriction : - site unique : ECO RI et BAM H1 - origine pmb9 : présence de rop

4 Contrôle de la réplication à partir des origines Col E1 / pmb9 : Réplication unidirectionelle à partir de Ori V Synthèse RNA II ( qui peut servir d amorce) et RNA I ( qui régule la structure de RNA II) Le complexe d ARN II / ARN I est défavorable à l initiation de la réplication. L interaction entre ARN II et ARN I stabilise par protéine rop donc défavorable à la réplication La mutation de rop baisse la stabilité, et donc il y aura une augmentation du nombre de copie Groupe d incompatibilité : 2 plasmides ayant la même origine de réplication appartiennent aux même groupes d incompatibilité et ne peuvent pas co-exister simultanément dans la même cellule hôte. Ex : pmb8 et col E1 Utilisation de pbr 322 pour le clonage : Eco Ri DNA insert tet Amp tet + BamH1 PBR 322 PBR 322 hybrid Cells will survive in ampicillin and tetracyclin Cells will survive in ampicillin but not tetracyclin Cells will not survive in ampicillin or tetracyclin Vecteur puc Il contient tous les éléments pour l expression d une protéine mais ce n est pas un vecteur d expression typique.

5 Propriété de la β galactosidase β galactosidase active N-term β -gal inactive Codé par les lac Z (plasmide puc) C-term β gal inactive Codé par lac Z (génome cellule hôte N-term active C-term On appelle cela : α-complémentation Mise en évidence de l activité béta galactosidase Substrat chromogène γ gal (incolore) : 5 bromo 5 chloro 3 indonyl αβ galactosidase. Réaction : γ gal en présence de β gal donne un produit bleu, donc on peut conclure à la présence d activité β gal. - site de clonage multiple ds PUC : polylinker, polycloning site. Plasmide puc : - marqueur de selection : amp R - origine de réplication modifiée - nombreux sites unique de restriction On réalise une sélection bleu blanc pour les recombinants L utilisation de PUC : vecteur de clonage facilitant grandement la sélection des vrais recombinants.

6 3.2.2 Vecteurs d expressions Possédant les caractéristiques vue pour les vecteurs de clonage, plus : - un promoteur (régulé) - un site de terminaison de la transcription (préférable) - un site de liaison pour le ribosome (RBS) - un codon stop (présent sur le vecteur ou l insert) Composants pour un vecteur d expression procaryote typique promoteur RBS répresseur Structural gene start stop T OrI Antibio resistance gène Plasmide pkk pbr 322 majoritairement - promoteur hybride ptac - séquence de Shine Delgarno, utilisable si clonage dans E. coli - site de polyclonage multiple (MCS) - terminateurs forts (SS et rrnb ARN ribosomiques terminateurs) - bactérie recommandée : DH5 α. Production d'une protéine non fusionnée. Production d une protéine non fusionné Utilisation : clonage non directionel (Cf TD) Vecteur d expression avec promoteurs phagiques

7 Vecteur pet Novagen Structure générale : E. coli BL21 : bactéries hôtes pour les plasmides présentant un promoteur T Vecteurs pour la production de protéines recombinantes avec des étiquettes = «tag» L étiquette confère à la protéine une particularité par rapport aux autres protéines de la cellule. Elle peut être clivable ou non. Protéine Etiquette Protéine de fusion Si on choisit une étiquette clivable, on met séquence pour site de coupure par protéase

8 Principales étiquettes utilisées pour produire des protéines de fusion Histidine : ajout de 6 à 8 résidus histidine à l extrémité C ou N terminale. Etiquette la plus courante. GST : Glutathion S transférase (20 kd) rajouté à l extrémité C ou N de la protéine Etiquette codant pour une partie de la protéine A de Staphilococus aureus Interaction avec les immunoglobulines Utilisation : Pour la détection des protéines par anti-corps dirigés contre l étiquette Pour la purification : extraction des protéines d un mélange La purification se fait par chromatographie d affinité, l élution des protéines fixées sur la résine étant facilitée. Sur IMAC (chromato d affinité sur métal immobilisé) pour l étiquette histidine Résine glutathion pour l étiquette GST Résine avec immunoglobuline pour l étiquette avec la protéine A. D autres étiquettes peuvent être utilisées, comme pour favoriser le repliement des protéines en absence de protéines chaperonnes par exemple (GST ou NuSA) Clivage des étiquettes Insertion entre la protéine et l étiquette d un site de reconnaissance reconnus par les protéases. Sites les plus usuels : Site entérokinase : Asp Asp Asp Asp Lys Coupe du côté C-ter de la lysine Site thrombine : Leu Val Pro Arg Site reconnu par le facteur Xa : Ile Glu Gly Arg

9 Exemples de plasmides d expression avec étiquette Etiquette clivable : plasmide ptrchis de Invitrogen ( -4,4 kd) P link : multiple site de reconnaissance de l enzyme de restriction Terminateur de transcription Ek site : Site de reconnaissance de l entérokinase (His) 6 : Etiquette LacO : opérateur Promoteur hybride Trp/lac : promoteur fort Amp R LacI q : répresseur de l opéron lactose. q = «up regulation» Prot en quantité importante OriColE 1 : entre 10 et 30 copies du plasmide Ici, l'étiquette est du côté N terminale Quand on utilise une expression régulée (présence de l opéron lactose), on trouve généralement un gène codant répresseur (ici, le répresseur de l opéron lactose). Protéine de fusion clivable produite à partir de ce plasmide : NH 2 ter His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys XXXXXXX Clivage par Etiquette Site de entérokinase Protéine NH 2 ter XXXXXXX : Séquence de la protéine clivée ajout entérokinase Purification de protéine avec étiquettes (chromato d affinité) Ex : Résine avec groupement glutathion Retient protéine avec étiquette GST Interaction est très élevée, constante d affinité forte Bonne sélectivité Ex : IMAC, avec ici Ni 2+ (retenue sur résine par acide nitrilotricaétique) Voir schéma poly de TP Formation de liaison de coordination (pour le Ni 2+ ) avec His. Elution soit par compétition avec ajout imidazole soit par modification du ph.

10 Vecteurs permettant l adressage des protéines Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf Souvent les protéines produites dans le système sont mal repliées car pas d environnement dans la cellule pour le faire Possible sécrétion protéine à l extérieur du cytoplasme de la bactérie pour faire le repliement. Technique : a) Fusion du côté Nter d un signal de sécrétion provoquant l envoi des ribosomes du côté de la membrane plasmique sécrétion de la protéine dans l espace périplasmique de E.Coli (Gram -). b) Le peptide signal est clivé sélectivement par la signal peptidase Cette stratégie de production de sécrétion de protéine est indispensable pour les protéines ayant des ponts disulufures car l intérieur de la cellule est réducteur (si protéine se forme à l intérieur, on a corps d inclusion, c est-à-dire agrégat de protéines purifiables mais qui ne sont pas dans la conformation active) c) Purification simplifiée par destruction de la membrane externe relarguage de la membrane externe puis élimination des sphéroblastes Plasmides permettant des stratégies de clonage n utilisant pas d enzyme de restriction. Utilisé pour HTC (clonage à grande échelle). Vecteur tout prêt à être inséré, sans passer par l étape de coupure par les enzymes de restriction Plasmide pet-30 LIC Stratégie LIC : «clonage indépendant de la ligase» Pas besoin de la ligase pour refermer. Cf. : TP de biotechnologie Peut servir à la production de protéines de fusion avec plusieurs étiquettes Système de GATEWAY Utilisation de recombinase. Phage λ Recombinaison du phage λ dans E. Coli aτp E. Coli aεb

11 Intégration de l ADN phagique dans le génome de E. coli Voir cours 2A Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf A ADN λ F P P Cl Excision att L x att R gal B P Cl A F P B bio gal B B bio att P x att B Intégration ADN E.coli Cycle lysogénique : att B x att P att L x att R recombinase : BP clonase Int, IHF Cycle lytique : att L x att R att B x att P recombinase : LR clonase Xis, IHF Réaction BP utilisée pour faire entrer le produit de PCR dans un vecteur att B 1 att B 2 att P 1 att P 2 gène ccdb Vecteur donneur BP clonase att R 1 att R 2 ccdb att L 1 att L 2 gène Produit non intéressant att P 1 ne se recombine qu avec att P 1 La sélection du clone se fait par destruction du vecteur ayant ccdb Clone d expression

12 Réaction LR pour faire passer un insert sur un autre vecteur Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf att L 1 att L 2 att R 1 att R 2 gène ccdb Clone d entrée Vecteur de destination LR clonase att B 1 att B 2 att P 1 att P 2 gène ccdb Clone d expression Produit A partir du moment où le clone d entrée est crée, on peut faire entrer le gène souhaité dans beaucoup d autres vecteurs. Notamment utilisable pour la mise en place d une étiquette. Résumé : Vecteur clonage Vecteur d expression Ori MCS : site de clonage multiple Promoteur fort Antibio B Terminateur 3.3 Transfert de plasmides de E.coli = transformation de E.coli E.coli n est pas naturellement transformable, c'est-à-dire prêt à capter de l ADN transgénique au moment de son cycle. Il faut perturber la membrane pour permettre la capture d un ADN étranger On rend la bactérie compétente (= capacité d intégrer un ADN).

13 Technique de transformation : Agent chimique : CaCl 2 à froid ; PEG (polyéthylène glycol) en présence de DMSO (diméthylsulfoxyde) ; agents chaotropes. Avec choc thermique (chauffage lent à 40 C puis passage dans glace) Electroporation : bactéries sont exposées à champ électrique intense Bonne efficacité, utilisée pour bactérie difficilement transformable. La transformation de E.coli est peu efficace : sur l ensemble des bactéries d un milieu, seule une petite proportion de cellules deviennent compétente, et sur les cellules compétentes, toutes ne captent pas de molécules d ADN (1/ si ADN circulaire, 1/ si linéaire, plasmide > 10 kb entrent difficilement dans la cellule) 4 Vecteurs phagiques vecteurs dérivés du bactériophage λ Phage λ a un génome de 48kb ( paries de base). Sur les 50 gènes de λ, beaucoup sont impliqués dans des recombinaisons et la lysogénie et ne sont pas essentiels ni à la multiplication du phage ni au cycle lytique, or c est ce qui nous intéresse. Les gènes non essentiels peuvent être éliminés et remplacés. Les génomes phagiques peuvent être manipulés pour pouvoir insérer de l ADN étranger. Les vecteurs dérivés utilisés pour le clonage ont des sites de restriction de part et d autre de la partie qu on veut éliminer. Vecteurs dérivés du phage λ cos : séquence de 12 nucléotides, simple brin, débordante indispensable à l empaquetage d ADN dans l ADN du phage. ADN de λ cos L cos R Elimination de la partie centrale par digestion au moyen d une enzyme de restriction Partie centrale cos L cos L cos R Epissage de l ADN étranger Empaquetage in vitro de la molécule recombinante

14 (Ici insert de 16-26kb) Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf Taille doit être équivalente à 48kb Mutant du phage peut être utilisé comme vecteur de clonage. Procédé d empaquetage tel que seules les molécules contenant l insert d ADN sont sélectionnées (partie gauche, droite ou centrale étant trop petites). Seul le recombiné peut y entrer. Stratégies d utilisation du vecteur λ : Stratégie de délétion / remplacement : cf. précédemment avec insert d environ 16-26kb cos 20kb cos ecori ecori Stratégie par insertion : insert d environ 0-12kb. Efficace mais techniquement difficile à gérer cos cos ecori Avantages vecteur λ : permet clonage de grand fragment et une sélection naturelle de ces grands fragments pendant l empaquetage. Inconvénients : plus difficile à manipuler.

15 5 Les vecteurs eucaryotes Présence sur le vecteur de séquences reconnues par la machinerie eucaryote (ori, promoteur, intron, ). Dans les cellules de mammifères, on peut utiliser des vecteurs navettes. Procaryote eucaryote Dans cellule procaryote amplification Dans cellule eucaryote expression 5.1 Principe général du vecteur «mammifère» Procaryote : Origine de réplication ; marqueur de sélection (résistance à un antibio + promoteur) Côté eucaryote : Promoteur : peut être différent du gène intéressé Gène d intérêt Site d épissage et de maturation de l ARN facilite transcription et traduction. Parfois présence d une Ori eucaryote Plus parfois un gène de résistance pour la sélection de la bactérie eucaryote. Le plus courant est le gène de la résistance à la néomycine Néo R. PROCARYOTE EUCARYOTE eucaryote Promoteur et activateur ATG : initiateur Gène d intérêt TAA : stop Site d épissage et de maturation de l ARN Ori eucaryote 5.2 Expression stable ou transitoire Expression est stable quand le plasmide est maintenu dans la cellule hôte eucaryote. 2 possibilités : Soit le plasmide a une origine R reconnue par la cellule hôte et le plasmide est recopié de manière épisomique (indépendamment du génome de la cellule hôte) Soit il n a pas d origine R propre mais on le force à s intégrer à l ADN de la cellule hôte et le transgène est répliqué en même temps que l ADN génomique

16 5.3 Exemples Plasmide prdna 3 (invitrogen) PMCV : promoteur eucaryote MCS : lieu insertion gène Site de terminaison SV40 : ori virale Néo R Site de polyadénylisation puc ori : fonctionne dans E.coli réplication relâchée = nombreuses copies Nécessité d avoir une protéine virale : AgT, protéine de la machinerie cellulaire qui reconnaît l ori du plasmide. Si cellule hôte produit AgT, on a réplication épisomique du plasmide et expression du transgène. Si cellule ne produit pas AgT, on sélectionne par ajout de néomycine donnant la possibilité que le gène s intègre au hasard. Expression du transgène stable

17 5.3.2 Vecteur pires (Clonentec) Pour cellule de mammifère. Pas d origine de réplication vecteur intégratif, c est-àdire qu il ne fonctionne que s il s intègre dans le génome. Vecteur pires : vecteur intégratif Après transfection : En absence d antibiotique, expression transitoire (forte souvent) du transgène Expression Temps (h)

18 En présence d'antibiotique, intégration dans le génome (1/100000) Intégration au hasard dans le génome : Si intégration dans une zone silencieuse, expression faible. Si intégration dans une zone très active, forte expression. En général, on ne copie qu un gène par génome. L expression est stable Vecteurs viraux : Baculovirus : pour expression dans les cellules d insectes. Virus de cellules mammifères : adénovirus rétrovirus : Genie_Gen-3-ClonageExpression.pdf virus de la leucémie murine de Moloney (nécessite une division cellulaire pour intégrer le gène) lentivirus (pas besoin de division cellulaire) Vecteurs pour le clonage de grands fragments d ADN : YAC : Yeast Artificial Chromosome large insert ARS URA 3 HIS 3 télomère centromère Origine de markers télomère réplication Insertion de 20 à 2000 kb dans la levure MAC : Mammalian Artificial Chromosome Insertion jusque 500 Mb dans les cellules de mammifères. 5.4 Transfection des cellules eucaryotes Méthode au phosphate de calcium (molécule insoluble. avec l ADN forme des aggrégats captés par les cellules par pinocytose ). Cette méthode ne marche pas pour toutes les cellules. Lipofection (ADN dans bicouche lipidique, avec des lipides chargés) Electroporation (Quasiment le seul moyen utilisable dans le cas de certaines cellules) Vecteurs viraux Vecteurs non viraux : PEI, lipofectamine Microinjections

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