TD de biologie moléculaire

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1 TD de biologie moléculaire Exercice 1 : Le but est la détermination de la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre et de MM. L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant : MM (Da) Ve (ml) Dextran Fibrinogène Catalase Lactoglobuline Rappeler à quoi correspond le Dalton. 2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM. Exercice 2 : Les temps de rétention (tr) de protéines, dont la masse moléculaire (MM) est connue, sont déterminés au cours d'une chromatographie sur Sephadex. Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM tr (min) Aldolase ,4 Lactate déshydrogénase ,4 Phosphatase alcaline ,4 Ovalbumine ,2 Lactoglobuline ,6 1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous? 2 - Pour la glucokinase, le tr est de 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent. Existe-t-il une autre méthode pour déterminer la MM? Exercice 3 Afin de déterminer la séquence d'un peptide P, plusieurs expériences sont réalisées : L'hydrolyse chymotrypsique de P a permis d'obtenir 2 fragments (A et B), dont l'hydrolyse acide totale (HCl 6N pendant 24h) a donné les résultats suivants : - A: 1 Ala, 1 Arg, 1 Cys, 1 Leu - B: 1 Asp, 1 Lys, 1 Tyr La méthode d'edman appliquée sur le fragment A a permis de libérer Ala puis Leu et sur le fragment B a permis de libérer Asp. La carboxypeptidase appliquée sur le fragment A a permis de libérer Cys. Seuls P et B absorbent la lumière à 280nm. Donner la structure primaire de P. Exercice 4 Afin de déterminer la séquence d'un peptide X, plusieurs expériences sont réalisées : L'hydrolyse trypsique de X a permis d'obtenir 2 fragments (X1 et X2), dont l'hydrolyse acide totale (HCl 6N pendant 24h) a donné les résultats suivants : - X1: 1 Val, 1 Arg, 1 Gly, 1 Leu - X2: 1 Asp, 1 Lys, 1 Ser La méthode d'edman appliquée sur le fragment X1 a permis de libérer Val puis Leu et sur le fragment X2 a permis de libérer un acide aminé acide puis un acide aminé ayant une fonction alcool. Donner la structure primaire de X. Exercice 5 L hydrolyse totale d un peptide donne 3 Ala, 1 Asp, 1 Gly, 1 Leu, 1 Lys, 1 Ser, 1 Tyr et 2 Val. L hydrolyse trypsique donne - Un tétrapeptide basique contenant Leu et donnant PTH-Ser puis PTH-Gly (dégradation d Edman) - Un heptapeptide acide qui absorbe dans l UV, et dont l hydrolyse chymotrypsique donne un tétrapeptide acide, qui absorbe dans l UV, qui donne un DNP-Val par la méthode de Sanger, et qui soumis à l action de la carboxypeptidase libère Tyr puis Ala, et un tripeptide neutre qui soumis à l hydrazinolyse libère Val. 1

2 Donner la structure primaire de ce peptide. Exercice 6 Comment déterminer la formule brute d un peptide? Ce décapeptide est composé de 1 Ala, 1 Leu, 1 Arg, 1 Cys, 1 Ile, 1 Tyr, 2 Gly, 1 Val, 1 Asp. La méthode d Edman donne Gly puis Leu. La carboxypeptidase libère Ala. L hydrolyse trypsique donne un tétrapeptide basique et un hexapeptide acide. Le trétrapeptide traité par l oxyde de plomb en milieu basique donne un précipité noir. L hydrolyse chymotrypsique de l hexapeptide donne o un dipeptide réagissant avec le réactif de Millon et possédant un acide aminé avec 2 carbones asymétriques o un tétrapeptide donnant un DNP-acide aminé acide par la méthode de Sanger. La thermolysine libère un acide aminé (Gly) et 3 peptides : un dipeptide contenant Ala et Val, un tripeptide contenant Arg, Cys et Leu et un trétrapeptide contenant Asp, Gly, Ile et Tyr. Quelle est la structure primaire du décapeptide? Exercice 7 Une hydrolyse trypsique libère le fragment N terminal d une protéine. Ce peptide après hydrolyse totale donne 1 Lys, 1 Arg, 1 Pro, 2 Thr, 1 Glu, 1 Ser, 2 Val, 1 Leu et 1 Tyr. La réaction de Sanger donne un DNP-Lys. L hydrolyse chymotripsique donne C1 et C2 qui sont basiques et ont pour composition : C1 : 1 Lys, 1 Pro, 1 Thr, 1 Val, 1 Leu, 1 Tyr C2 : 1 Arg, 1 Thr, 1 Ser, 1 Val, 1 Glu. Quelle est la position de C1 et C2 par rapport au N terminal? Pourquoi? L attaque de C1 par la carboxypeptidase donne un acide aminé aromatique, puis la leucine, puis un acide aminé neutre à 5 atomes de carbone. L hydrolyse partielle de C2 donne entre autres trois peptides dont les compositions sont les suivantes : 1 Thr, 1 Glu, 1 Val ; 1 Ser, 1 Thr, 1 Val ; 1 Arg, 1 Ser, 1 Val. Quelles sont les séquences de C1, de C2 et du peptide total? Exercice 8 : La séquence d ADN du brin sens de 5 vers 3 est : ACC ATG TTT TCC GAC CGG TAG CTG AAA a) Quelle est la séquence du brin matrice de 5 vers 3? b) Quelle est celle de l ARNm correspondant de 5 vers 3? c) Quelle est celle de la protéine? d) Si une mutation change la 13eme base de G en C, que se passe-t-il? e) La 15eme de C en T? f) La 19eme de T en A? g) Si un A est inséré en position 6? h) En position 19? Exercice 9 : Une protéine humaine est composée de 302 acides aminés. Voici un fragment d'adn simple brin contenant le début de la phase codante du gène correspondant : TATGCCTAGCTGCGGAGTTGTTACATCGACTGGTTTGCTGGATCATCGTGG 1. Identifiez le début de la phase codante du gène. Quel est le brin d'adn porteur de l'information génétique responsable de la formation de la protéine? 2. Ecrivez la séquence nucléotidique du fragment d'arnm codant le début de la protéine. 3. Déduisez le début de la séquence de la protéine. 4. Une protéine mutante dans laquelle la première sérine est remplacée par une arginine a été isolée. Quelles mutations nucléotidiques rendent compte de ce changement d'acide aminé? 5. Dans une pathologie, une forme écourtée de la protéine est retrouvée : seuls les trois premiers acides aminés sont présents. Quelle mutation nucléotidique peut-être prédite? 2

3 Exercice 10 Observer les résultats de l électrophorèse en gel d agarose coloré au BET et observé sous UV ADN viral non digéré Marqueur (ADN viral digéré Hind III) ADN génomique digéré Eco R I Le génome humain a une taille d environ pb. Celle du virus utilisé, un phage lambda, est de 45 kb. 1- Quelle est la masse d ADN contenue dans une cellule humaine et combien de cellules sont utilisées pour l extraction d 1 µg d ADN génomique? (masse molaire moyenne d un nucléotide : 330 g, Constante d Avogadro N = 6,02 x mol -1 ) 2- Quelle est la fréquence statistique théorique du site de restriction Eco R I (GGATCC : 6 pb) sur l ADN génomique humain et la taille moyenne des fragments obtenus? 3- En supposant que la digestion effectuée sur l ADN génomique soit totale, pouvez-vous expliquer la différence d aspect entre les bandes nettes obtenues pour les fragments de restriction du marqueur et la tache diffuse (= «Smear») obtenue pour l ADN génomique digéré? 4- Comment obtenir un résultat d électrophorèse qui permettrait une étude de restriction précise d un gène humain? Exercice 11 Quelles amorces de PCR (longues de 10 bases chacune) permettraient l amplification de l ADN 1 mais pas de l ADN 2, puis quelles amorces utiliser pour amplifier les 2 fragments d ADN? 5 ATGCCTAGGTCATTTACCGTAAATACCTGATTGCTAGGTACCAGGGCTATGGCTAGGTCAAAGGT 3 3 TACGGATCCAGTAAATGGCATTTATGGACTAACGATCCATGGTCCCGATACCGATCCAGTTTCCA 5 5 ATACCTAGCACATTTACCGTAAATACCTGATTGCTAGGTACCAGGGCTATGGCTAAATCAAACGT 3 3 TATGGATCGTGTAAATGGCATTTATGGACTAACGATCCATGGTCCCGATACCGATTTAGTTTGCA 5 Exercice 12 Pour cloner vqsr (1254 pb), les auteurs ont réalisé une PCR dans 50 μl (volume final), en utilisant 50 ng d ADN génomique de Pa (génome 6,3 x 10 6 pb) et 0,2 mm de chaque dntp (MM d un désoxyribonucléotide 330 Da ; Constante d Avogadro N = 6,02 x mol -1 ). a) En admettant que le rendement de la PCR est de 100% calculez la quantité d amplicons (en nombre de copies et en μg) produite après 20 cycles? b) En admettant que dans la séquence à amplifier il y a une proportion équivalente de chacun des nucléotides, la quantité de dntps, ajoutée dans l échantillon, sera-t-elle suffisante pour aller au bout des 20 cycles? Exercice 13 Un plasmide est digéré soit par l enzyme EcoRI, soit par BamHI, soit par un mélange des deux. Quelle est la taille du plasmide avant digestion? Justifiez votre réponse. Combien de sites chaque enzyme possède-t-elle? Justifiez votre réponse. Quelle est la carte de restriction du plasmide? Justifiez votre réponse. Gel d agarose 1240 pb 1130 pb 750 pb EcoRI BamHI EcoRI et BamHI 1650 pb 810 pb 660 pb 950 pb 700 pb 630 pb 540 pb _ Sens de migration pb 120 pb +

4 Exercice 14 Un plasmide est soumis à la digestion par deux enzymes de restriction afin de rechercher les sites de coupures de ces deux enzymes et de construire les cartes de restriction correspondantes ainsi que la carte combinée. La digestion terminée, chaque lot d'adn est soumis à une électrophorèse en gel d agarose qui sépare les fragments d'adn selon leur taille. Le document suivant donne les électrophorèses après des digestions simples et multiples. 1 ) Quel est la taille du plasmide en paires de bases? 2 ) Combien possède-t-il de sites de coupure pour l'enzyme EcoRI? Pour l'enzyme BamHI? 3 ) Ordonnez les différents fragments obtenus les uns par rapport aux autres. - EcoRI BamHI EcoRI + BamHI Exercice 15 Mêmes questions que les exercices précédents. Fragments obtenus par EcoRI en pb : Fragments obtenus par HaeIII en pb : Fragments obtenus par BamI en pb : Fragments obtenus par la triple digestion en pb : Exercice 16 Mêmes questions que les exercices précédents. Fragments obtenus par EcoRI en pb : Fragments obtenus par BamI en pb : Fragments obtenus par la double digestion en pb : Exercice 17 Mêmes questions que les exercices précédents. Fragments obtenus par EcoRI en pb : Fragments obtenus par BamI en pb : Fragments obtenus par la double digestion en pb : Exercice 18 : examen mars 2010 Partie 1 (TD/TP) Voici la séquence du gène procaryote Kiawelam : 5' TAT ATT CCT ATG CCC GTA CGT AAA TTT CTA GGT TAT TCC AAG GAC GGC GTA CGA GGC TAT TCG GCA GAC GAA CAT TGT GGT AAA GTA TAT TTA ATG TAA GTA AGG CTA GGC TCC AGC CTT 3' 4

5 1) Ce brin est-il le brin matrice? Justifiez votre réponse. 2) Qu est ce qu une PCR? 3) La Taq polymérase utilisée en PCR a-t-elle des spécificités par rapport à une ADN polymérase classique? 4) Proposez des amorces de PCR pour amplifier cette portion d ADN. Indiquez leurs orientations. 5) Qu est ce qu une ARN polymérase? 6) Indiquez la séquence primaire de la protéine Kiawelam. Est-elle forcément exacte? Justifiez votre réponse. 7) Quelle(s) méthode(s) permet(tent) de détecter et/ou quantifier une protéine? Partie 2 (cours) Horizontalement 5. spécifique à l'arn 9. support de l'information génétique 10. sucre utilisé pour faire des gels 12. enzyme permettant la synthèse du dernier fragment d'okasaki 14. absent chez les procaryotes 16. gènes régulés ensemble 18. en face de la thymine 19. méthode d'amplification d'adn avec suivi bases lues ensemble 21. apporte l'acide aminé 22. lu par les ribosomes 23. suite d'acides aminés 1.3. Verticalement 1. protéine pathogène 2. insertion d un gène dans un vecteur ou reproduction d un être vivant à l'identique 3. histones et ADN 4. enzyme réalisant la synthèse d'acides nucléiques 6. système de dégradation des protéines mal conformées 7. modification du matériel génétique 8. sert à la traduction 11. petit nom des acides aminés 13. produit de la transcription 15. un des sucre avec 2 OH 18. catalyse la liaison peptidique 5

6 Exercice 19 Un ADNc de 1,5 kb codant une protéine X chez la souris a été cloné au site de restriction EcoRI dans un vecteur pks (figure 1). Après ligation, des bactéries compétentes sensibles à l ampicilline sont transformées par le produit de cette ligation puis étalées sur un milieu complété en ampicilline, X-gal et IPTG. Figure 1 : vecteur pks. L ADN plasmidique de 2 colonies blanches A et B est extrait. Les plasmides de ces deux colonies sont utilisés comme matrices pour synthétiser 2 sondes ARN marquées au 32 P. Sonde 1 : transcription à partir du promoteur T7 sur la matrice A linéarisée par l enzyme de restriction XhoI (cet ADNc ne contient pas de site XhoI). Sonde 2 : transcription à partir du promoteur T7 sur la matrice B linéarisée par XhoI. Une expérience de Northern est effectuée sur des ARNm purifiés de cellules murines avec chacune des sondes 1 et 2 (figure 2). 1) Qu est ce qu un transformant? Sondes Kb Figure 2 : Résultats du Northern Blot réalisé avec les sondes 1 et 2 sur des ARNm purifiés de cellules murines. 2) Pourquoi des colonies blanches sont choisies pour synthétiser les deux sondes? 3) Aucune hybridation n est observée pour la sonde 2, proposez une explication. Un des deux plasmides est donc utilisé pour effectuer dans un premier temps de la transcription in vitro à partir du promoteur T7, après digestion du plasmide par XhoI. L'analyse de la séquence de l'adnc du gène X est effectuée par mutagenèse par insertion ou délétion : 4 types de délétions ou d'insertions ont été testées (figure 3). 6

7 Figure 3 : Séquence de l ADNc cloné avec la position des insertions et des délétions qui ont été réalisées. Les ARNs obtenus sont concentrés et marqués au phosphore 32 P avant d'être déposés sur un gel de polyacrylamide. Les ARNs sont visualisés par autoradiographie (figure 4). 4) Qu est ce qu un ADNc? Figure 4 : ARNs obtenus à partir d un témoin et des constructions d ADNc 1, 2, 3 et 4. 5) Expliquez pour chacune des constructions les résultats obtenus sur la figure 4. Les ARN obtenus dans chacun de ces 5 cas ont été utilisés pour effectuer une traduction in vitro en présence de ( 35 S) - méthionine, ainsi que les 19 autres acides aminés non radioactifs. Les produits protéiques sont déposés sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS, et révélés par autoradiographie (figure 5). Figure 5 : Western blot sur les produits protéiques obtenus à partir du témoin et des constructions 1, 2, 3 et 4. 6) Interprétez les résultats de la figure 5 dans chacun des 5 cas en comparant avec ceux de la transcription (figure 4). La même traduction in vitro a été effectuée mais cette fois-ci sans acide aminé radioactif à partir des 5 mêmes matrices. Les produits protéiques ont été déposés sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS, puis transférés sur une membrane et détectés par différents anticorps couplés à un fluorochrome (anticorps 1 et anticorps 2). Anticorps n 1 : dirigé contre la moitié NH2 terminale de la protéine X. 7

8 Anticorps n 2 : dirigé contre la moitié carboxy terminale de la protéine X. 7) Donnez une interprétation pour chacune des 4 constructions. Figure 6 : westerns blots avec les anticorps 1 et 2 révélés avec le substrat de l enzyme couplé à l anticorps. Exercice 20 Juin 2011 Au cours de sa thèse en biologie, une étudiante souhaite réaliser une extraction plasmidique afin d étudier les effets, sur des levures, de la protéine etonil dont le gène a précédemment été cloné chez E. coli dans le vecteur plasmidique pexpr-iba17. Ce vecteur contient les origines de réplication chez les procaryotes et les eucaryotes, les gènes de résistance à l ampicilline AmpRs et à la néomycine NeoR, le MCS (site de clonage multiple), et le promoteur du CMV pour permettre l expression du gène etonil en système eucaryote. Le clone recombinant est gardé à -80 C en milieu LB additionné de glycérol. 1- Qu est ce qu une origine de réplication? 2- A quoi sert le MCS? 3- Pourquoi réaliser le clonage chez E. coli pour une utilisation chez la levure, eucaryote unicellulaire? 8

9 L étudiante fait pousser son clone d E. coli recombinant en milieu liquide toute la nuit à 37 C. Le lendemain, la culture est positive. L extraction plasmidique est réalisée. Le contrôle sur gel d agarose ne montre malheureusement aucun plasmide. 4- A quoi cet échec peut-il être dû? L étudiante décide alors d utiliser du LB supplémenté en néomycine. Le lendemain, le milieu est limpide indiquant que la bactérie ne s est pas développée. L étudiante pense que la bactérie a perdu le plasmide, donc la résistance à l antibiotique, et réalise une PCR sur le gène etonil afin d en être sûre. 5- Qu est ce qu une PCR? La PCR est positive, le gène etonil est bien présent dans le clone conservé à -80 C. L étudiante décide alors de faire pousser son clone en LB supplémenté en ampicilline. Le lendemain, la culture est positive et l extraction aussi. 6- Pourquoi l ampicilline a-t-elle permis de réaliser l expérience et non la néomycine? 7- Quelle conclusion personnelle pouvez-vous tirer de ces échecs? Exercice 21 Une équipe veut étudier le gène Schumeucurt et la protéine correspondante. Ce gène se trouve chez une souche de levure impliquée dans la fermentation du chou pour la production de choucroute. Ils commencent leurs analyses par une RT-qPCR ciblant ARN messager Schumeucurt dans deux échantillons contenant la levure, un de choucroute et un de fromage. 1- Qu est-ce qu une RT-qPCR (principes, étapes, contrôles)? Quelles informations sont obtenues? L ARNm est bien présent en quantité importante dans la choucroute mais absent du fromage. Le produit de ce gène semble donc nécessaire pour la fermentation du chou. Les auteurs isolent la souche de levure et veulent cloner l ADNc correspondant dans un vecteur d expression. 2- Qu est-ce qu un ADNc? Pourquoi ne pas cloner directement le gène? 3- Quelles sont les étapes permettant ce clonage (en quelques phrases avec éventuellement un schéma)? Voici le début de la phase codante du gène. 5 ATG TTT CCA GCC GCC AAA GCT TCA CCA ATT GCC GGG AGG 3 3 TAC AAA GGT CGG CGG TTT CGA AGT GGT TAA CAA CCC TCC 5 Voici la fin de la phase codante. 5 TTT TGC ACC TCG TTA TAA 3 3 AAA ACG TGG AGC AAT ATT 5 4- Proposez deux amorces de PCR (de 5 en 3, de 10 bases chacune) pour amplifier l ensemble de la phase codante. Afin de cloner ce produit de PCR dans un vecteur par digestion enzymatique, le site saci est ajouté à l amorce sens et le site sali à l amorce anti-sens. 5- Pourquoi les auteurs ont-ils utilisé deux enzymes différentes? Après PCR, digestion, ligature et transformation, 55 clones blancs sont obtenus. Une extraction plasmidique est réalisée sur un clone blanc. Il est soumis à la digestion par EcoRI ou par BamHI ou par les deux enzymes de restriction afin de construire la carte de restriction combinée. La digestion terminée, chaque lot d'adn est soumis à une électrophorèse en gel d agarose qui sépare les fragments d'adn selon leur taille. 6- Quel est le principe d une électrophorèse en gel d agarose? 9

10 Voici les résultats de l électrophorèse (taille indiquée en paires de bases) : EcoRI BamHI Double digestion Quelle est la taille du plasmide en paires de bases? 8- Combien de sites de coupure pour l'enzyme EcoRI le plasmide possède-t-il? 9- Et pour l'enzyme BamHI? 10- Ordonnez les différents fragments obtenus les uns par rapport aux autres. 11- Sachant qu un site EcoRI trouve dans le site de clonage multiple avant saci et un site BamHI trouve dans le site de clonage multiple après sali, que l ADNc mesure 1650 paires de bases et que seul un site Eco RI est présent dans l ADNc en position 60, pensez-vous que le clonage s est bien passé? Justifiez votre réponse. Les auteurs utilisent ce plasmide pour exprimer la protéine chez E.coli. 12- La structure primaire sera-t-elle la même chez E. coli et chez la levure? Et les structures secondaires, tertiaires et quaternaires? Justifiez votre réponse. 13- Proposez une suite à ces expériences. 10