Génomique. discipline scientifique dont l objectif est de cartographier, séquencer et analyser les génomes

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1 Génomique discipline scientifique dont l objectif est de cartographier, séquencer et analyser les génomes

2 Vue d ensemble du génome humain (2004) Taille du génome Taux d erreur dans la séquence 3.08 Gbases 1/ bases Nombre de gènes identifiés Nombre de gènes (prédits et identifiés) Nombre moyen d exon par gène 10,4 Régions traduites en protéines 34 Mbases (1,1%) Régions transcrites non traduites 21 Mbases (0.7%)

3 Génomique aujourd hui Définition initiale: Discipline scientifique dont l objectif est de cartographier, séquencer et analyser les génomes Le séquençage à haut-débit des génomes est devenu une activité de routine. Développement de nouvelles disciplines scientifiques (transcriptomique, protéomique, bioinformatique, pharmacogénétique, ) Pour 40-60% des gènes identifiés, la fonction reste inconnue

4 La post-génomique Génomique Post-génomique Génomique structurale Génomique comparative Génomique fonctionnelle Analyse globale du génome permettant d assigner des fonctions aux gènes Définir l organisation et le contrôle des processus génétiques qui s associent pour faire le fonctionnement physiologique ou pathologique d une cellule, d un organe ou d un organisme

5 approche gène candidat séquençage du génome humain vision globale du génome Post génomique Tous les gènes sont des candidats potentiels! 5

6 Génomique structurale Objectif: détermination de la structure tridimensionnelle des protéines à partir des données du génome Etudier la fonction des milliers de gènes «inconnus» à partir de la relation structure fonction des protéines

7 «Human kinome» = Ensemble des protéines kinase exprimées chez l Homme 1- Définition d une séquence consensus de site catalytique à partir des kinase connues 2- Identification de nouveaux gènes codant potentiellement des protéines kinases à partir de leur séquences

8 173 inhibiteurs «human kinome» 57 Ser/Thr Kinases Production des protéines à partir des séquences Test d inhibiteurs connus des kinases Identification de cibles moléculaires

9 Génomique comparative Analyse et comparaison de l ADN de différents organismes Conservation de l ADN entre espèces en particulier au niveau des exons Similarité Homme - singes 95% Similarité Homme - souris 85% ~99% des gènes humains ont un équivalent (orthologue) chez la souris

10 Génomique comparative Identification des séquences conservées entre différents organismes Séquences codantes Identification de la fonction d un gène à partir de la fonction des orthologues

11 Génomique Fonctionnelle Génomique = Description physique Sites de fixation Exons Eléments répétés La Génomique Fonctionnelle = fonctionnement des génomes Mutation Transcription ARN Insertion Excision Régulation Traduction Protéine Ex: évaluer le fonctionnement global des gènes dans une maladie

12 Génomique fonctionnelle et maladies Phénotype malade Variations génétiques facteurs d environnement et facteurs de risque Effet individuel très modeste Accumulation et combinaison d un nombre important de variations Modulation de l effet des variations génétiques Faible contribution de chaque variations génétique au phénotype Intérêt d une analyse plus globale

13 Etude d expression des gènes Niveau d expression Activité biologique Objectif: Vue d ensemble de l expression du génome (profil d expression génique) Profil d expression génique dynamique Connaissance de la fonctions des gènes

14 Etude d expression des gènes

15 Techniques d étude du transcriptome Développement lié au séquençage des génomes: Production de sondes nucléotidiques spécifiques pour chaque gène Etude à grande échelle et simultanée Miniaturisation & Robotisation Traitement d un grand nombre de données bioinformatique Les techniques classiques (Northern blot, PCR quantitative) ne sont pas applicables

16 Puces à ADN (microarrays) Matrice de sondes cible marquée hybridation Mesure

17 Principe de base = hybridation 17

18 Application des puces à ADN Sondes Cible Référence Criblage de banques ADN ADN Gress TM et al. (1992) Mam. Genome 3: Transcriptome ADN ARN Schena et al. (1995) Science 270: Oligo fingerprinting ADN Oligos Drmanac S. et al. (1996) Genomics 37: Reséquençage Oligo ADN Kozal MJ et al. (1996) Nat. Med. 2: Phénotypage ADN ADN Gingeras et al. (1998) Genome Res. 8: SNP Oligo ADN Winzeler et al. (1998) Science 281: CGH ADN ADN Pollack JR. (1999) Nature 23: DNA-BP ADN Protéines Bulyk et al. (1999) Nature Biotech. 17: Suivi de réplication ADN ADN Khodursky et al. (2000) PNAS 97: Détection de gènes ADN ARN Penn et al. (2000) Nature Genet. 26: ChIP-chip ADN ADN Iyer et al. (2001) Nature 409: Validation de gènes ADN ARN Shoemaker et al. (2001) Nature 409: Taille des ARN ADN ARN Hurowitz et al. (2003) GenBiol 5: R2

19 Puces à SNP (single nucleotide polymorphism) SNP GCGAATCGAGATA G AATGGACCCGTGCTAA ATCGAGATAAATGGACCCG ATCGAGATATATGGACCCG ATCGAGATACATGGACCCG ATCGAGATAGATGGACCCG Individu Homozygote Individu Hétérozygote Pour un SNP donné, on synthétise 4 oligonucléotides ayant la séquence connue et les 4 bases possibles en position centrale. On hybride la puce constituée de ces oligonucléotides avec l ADN d un individu.

20 Puces à ADN: transcriptome cibles complexes d ARN Hybridation Réseau de sondes Mesure simultanée du niveau d expression de milliers de gènes

21 Pathologies cardiaques 30% des causes de décès Forte prévalence Renforcement du poids de ces maladies avec le vieillissement de la population Facteurs de risque environnementaux et génétiques

22 Profils d expression génique 1. Découvertes physiopathologiques 2. Phénotypage moléculaire

23 Stewart S et al. Eur J Heart Fail 2001;3: Insuffisance cardiaque: plus grave que le cancer?

24 Insuffisance cardiaque: remodelage myocardiaque A B C D Prédisposition à la maladie Anomalie structurale Maladie symptomatique Stade réfractaire REMODELAGE CARDIAQUE REMODELAGE TRANSCRIPTOMAL

25 Insuffisance cardiaque: processus de remodelage complexe apoptose circuits biomécaniques métabolisme stress oxydant cycle du calcium REMODELAGE CARDIAQUE traitement facteurs génétiques facteurs d environnement cardiopathie initiale

26 Hypothèse de travail Etude du remodelage transcriptomal associé aux pathologies cardiaques Signatures moléculaires des processus pathologiques Biomarqueurs pertinents pour la prise en charge des malades

27 Insuffisance cardiaque 44 patients en attente de transplantation CMI CMD autres n= Age (années) Sexe (H/F) 16/1 19/1 3/4 FEVG % paramètres cliniques 2 échantillons du VG & 2 échantillons du VD 176 échantillons biologiques

28 Insuffisance cardiaque VG Cœur explanté VD 44 patients 176 échantillons Myopuce contenant 4217 gènes (quadriplicates) 352 puces données d expression

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30 Analyse d expériences de puces à ADN x 10 s cibles s sondes DELUGE DE DONNEES TRAITEMENT EN MASSE DE L INFORMATION Traitement des données Outils d aide à l interprétation

31 Traitement des données - Acquisition des données & Filtration - Normalisation - Concordance des mesures Consolidation des données Théorie Normalisation Réalité

32 Interprétation des données Detection de gènes différentiels Méthodes statistiques Detection de groupes de gènes co-regulés Méthodes de «clustering» Annotation fonctionnelle Banques d information (www)

33 gènes Clustering - Eisen et al. (1998) échantillons Données d expression code couleur clustering hiérarchique

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35 Définitions Cluster Groupe de gènes co-régulés Profil Mesure d expression d un échantillon Signature Niveaux d expression de gènes caractéristiques d un échantillon Fonction Régulation

36 Signature moléculaire N T1 T2 T3 N T1 T2 T3 N+T1 T2+T3 Notion relative: pour un échantillon donné, il existe plusieurs signatures possibles, selon ce à quoi on compare cet échantillon

37 Correlation = Fonction Eisen et al. (1998) PNAS 95: Les gènes d expression corrélée participent à une même fonction biologique

38 Cluster = Régulation Tavazoie et al. (1998) Nature Genetics Sites de fixation Exons Eléments répétés

39 mitochondrie mort cellulaire cytosquelette métabolisme synthèse protéique matrice extracellulaire peptides natriurétiques transport ionique adhésion

40 Stratification moléculaire du risque 44 patients en attente de transplantation Sévérité clinique Stable (n=13) UNOS 2 et stable sur 3 mois Intermediate (n=19) UNOS 1B/2 Deteriorating (n=12) UNOS 1A Analyse statistique Marqueurs de sévérité

41 Stratification moléculaire du risque VG VD VG VD S D S D S D S D VG VD S D S D Prédicteurs VG Prédicteurs VG Prédicteurs VG/VD

42 Prédicteur On construit un profil moyen rouge et un profil moyen vert. On mesure la distance de chaque échantillon à ces 2 profils.

43 Stratification moléculaire du risque ventricule gauche ventricule droit

44 Prédicteurs moléculaires du pronostic á un stade précoce de la maladie à partir de biopsies cardiaques Heidecker, B. et al. Circulation 2008;118:

45 Perspectives maladie Prédicteurs moléculaires Médecine génomique problématique clinique Profil d expression génique

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52 Génome Le génome est le patrimoine génétique complet d un organisme Le génome comprend l ensemble des ADN d un organisme Chaque type d organisme vivant (plante ou animal) possède son propre génome

53 Génome humain > 3 milliards de nucléotides Séquence linéaire d ADN de 2 mètres dans chaque cellule Si chaque paire de bases est représentée par une lettre il faudrait l'équivalent de 800 bibles pour écrire le génome humain.

54 Acide Désoxyribo Nucléique Double hélice composée exclusivement de 4 nucléotides Appariement des bases deux à deux 2 brins anti-parallèles

55 Gène Unité d'hérédité contrôlant un caractère particulier. Cet élément génétique correspondant à un segment d'adn ou d'arn (virus), situé à un endroit bien précis (locus) sur un chromosome. Chaque région de l'adn qui produit une molécule d'arn fonctionnelle est un gène.

56 Gène Exons Eléments répétés Sites de fixation Introns Exons: Eléments du gène qui codent les protéines Introns: Séquences d ADN non codant entre les exons

57 Expression des gènes Transcription Le gène est transcrit en ARN messager Traduction L ARN messager est traduit en protéine

58 Expression des gènes 58

59 Expression des gènes génome humain cellule spécialisée gènes 100 to transcrits transcrits épissage alternatif transcrits liés à la fonction propre de la cellule 59

60 human genome project Cartographier le génome humain Séquençage de tout l ADN d un individu