Techniques de quantification des acides nucléiques par PCR

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1 Outils d études cellulaire et moléculaire Techniques de quantification des acides nucléiques par PCR Jérôme Gay-Quéheillard L2 BHTS 1

2 1. Matériel biologique nécessaire à une PCR 1.1. préparation de l ADN - Nécessité d échantillons d acides nucléiques pour toute étude de génétique moléculaire - Quantité utile infime (qq µg) - Etude facilitée/présence de l information génétique totale dans chaque cellule nucléée A partir de sang total - Pratique très courante (qq ml de sang suffisent) - Facilité de prélèvement, de transport et de conservation des échantillons 2

3 A partir de tissus ou cellules en culture - Matériel biologique: biopsies, cellules en culture - Homogénéisation/potter après congélation en N 2 liquide 1.2. préparation des ARN - Plus difficiles à étudier car fragiles (activité des RNAses) - Travail en conditions stériles (RNAses microbiennes) - Utilisation de matériel autoclavé (eau, tampon, tubes ) - Homogénéisation des tissus et cellules/homogénéisateur (Polytron, Ultra-Turrax ) 3

4 - Solutions nécessaires: Tp avec détergent puissant (SDS) agent dissociant (chlorure ou thiocyanate de guanidine) solution Tp acétate agent réducteur à haute concentration (2- mercaptoéthanol, DTT) - Deux impératifs: inhiber les RNases endogènes dénaturer les acides nucléiques et dissocier les protéines fixées - Elimination des débris cellulaires/centrifugation - Extraction des ARN 4

5 - Technique couramment utilisée: précipitation différentielle de l ARN et de l ADN selon le ph et la concentration d éthanol solutions commerciales prêtes à l emploi (RNAzol, TRIzol, etc ) mais coût élevé kits commerciaux d extraction (facile, rapide et coût modéré) 1.3. dosage des acides nucléiques - Dosage très précis rarement nécessaire - Estimation/photométrie: absorption forte des bases dans l UV à 260 nm - 1 U DO à 260 nm: solution d ADN db (50 µg/ml) solution d ARN ou ADN sb (25 µg/ml) 5

6 2. La technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.1. introduction - Technique découverte par Kary Mullis (1986) - Obtention du prix Nobel de chimie (1993) - Outils indispensables en biologie moléculaire - Technique PCR en temps réel par R. Higuchi (1992) - Applications phénoménales (diagnostic clinique, recherche fondamentale, agroalimentaire) - Développement permanent 6

7 2.2. principes généraux - Réplication à la chaîne d une séquence d ADN par des enzymes, les ADN polymérases - Amplification exponentielle (10 6 après 30 cycles) - Technique reposant sur 2 principes: propriétés de synthèse enzymatique et d initiation des ADN polymérases ADN dépendantes thermostables l hybridation et la déshybridation des brins complémentaires d ADN est fonction de la t C - Contrôle de l activité enzymatique des ADN polymérases par le contrôle de la t C - Cycles de dénaturation/hybridation/élongation 7

8 2.3. réalisation pratique 1. Etape de dénaturation (95 C, 2-5 min): déshybridation de l ADN (t C>Tm) cassure et dénaturation des structures et enzymes secondaires homogénéisation du milieu réactionnel/agitation thermique activation des ADN polymérases 2. Etape d hybridation (56-64 C, 2-60 sec): accrochage des amorces «sens» et «anti sens» aux ADN matrices par une t C thermodynamiquement favorable (t C<Tm de l amorce ayant le + faible Tm) 3. Etape d élongation (72 C, sec): synthèse de l ADNc par les polymérases à partir des dntps libres du milieu réactionnel 8

9 Cycles renouvelés entre 20 et 50 fois suivant la quantité de cible de départ et le but poursuivi mais attention!!! Il est inutile de trop augmenter le nombre de cycles car plus d amplification exponentielle au-delà de cycles obtention d un plateau Raisons: dimérisation des amorces apparition de sous-produits de réaction à pouvoir inhibiteur (pyrophosphate) épuisement et dénaturation des composants de la réaction compétition entre amorces et fragments de DNA amplifié 9

10 Théoriquement, le nombre de copies = 2 n (n nb de cycles) En pratique, rendement plus faible car jamais de 100% mais plutôt 85% Si le rendement reste constant tout au long de l amplification, le nb de copies est: (1 + R) n R rendement et n nb de cycles Ex: si R = 85%, le nb de copies est (1,85) n = 10 6 pour une PCR de 30 cycles 10

11 La technique d amplification par PCR 11

12 Le principe de la PCR en images -Technique puissante pour amplifier exponentiellement de faibles quantités d ADN - Obtention finale de grandes quantités de matériel génétique - Répétition de trois étapes (sur cycles max) - dénaturation de l ADN - accrochage des amorces (annealing) - synthèse de l ADN dénaturation (95 C) annealing (50-60 C) matrice d ADN 12

13 synthèse du nouvel ADN (72 C) copies d ADN produites identiques à la matrice 1: échelle de taille 2,3,5: contrôles négatifs 4, 6-9: produits de PCR (taille 280 pb) analyse du produit de synthèse par électrophorèse sur gel d agarose et marquage au bromure d éthidium 13

14 4. Analyse du produit d amplification emploi de l électrophorèse acides nucléiques = molécules polyanioniques uniformément chargées possibilité de migration en champ électrique charge relative constante discrimination des molécules/effet de filtration du gel théories de l électrophorèse: la mobilité «u» dans un champ électrique au sein d un gel doué de pouvoir de filtration est: Log u = Log u 0 K r C Log u 0 : mobilité de la molécule en milieu liquide K r : coefficient de retardement dû au gel, lui-même une fonction de la masse moléculaire de la molécule C: concentration du gel 14

15 La vitesse de migration d une molécule d acide nucléique sera fonction de deux paramètres: masse moléculaire: nombre de bases ou de paires de bases concentration d acrylamide ou d agarose du gel le gel de polyacrylamide séparation des petits fragments (<1000 pb) purification des oligonucléotides de synthèse et élimination des nucléotides libres détermination des séquences de DNA gel coulé entre deux plaques de verre 15

16 migration verticale le gel d agarose support le plus utilisé séparation de fragments entre 0,5 et 20 kb gels coulés à l horizontale Cuve à électrophorèse et générateur 16

17 Mini cuve à électrophorèse Maxi cuve à électrophorèse et générateur 17

18 Mini cuve à électrophorèse A B A: Distribution des échantillons sur le gel B: Peignes à puits 18

19 Pourcentage d acrylamide Pourcentage d agarose 0,6 à 0,8 0,9 à 1,2 1,2 à 1,5 Taille des fragments à séparer (pb ou nucléotides) 200 à à à à 50 Taille des fragments à séparer (kb) 1 à 20 0,5 à 7 0,2 à 5 Choix de la concentration du support de l électrophorèse en 19 fonction de la taille des fragments à séparer

20 3. La Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) - Similaire à la PCR - Permet l amplification de faibles quantités d ARN - Technique utilisée dans le but de détecter des virus ou des transcrits cellulaires d ARN matrice ARN (ARN poly A) priming pour la reverse transcription à l aide d un primer oligo-dt 20

21 l enzyme reverse transcriptase va synthétiser le brin complémentaire d ADNc à partir de l ARNm la RNAse H va ensuite détruire le brin d ARNm qui a servi de matrice; il reste le brin d ADNc qui pourra être amplifié par PCR 21

22 amorces oligonucléotides ADNc Taq ADN polymérase la Taq polymérase peut ensuite synthétiser les brins complémentaires de l ADNc ADN double brin 22

23 Différents cycles d amplification en PCR 23

24 4. Les composants de la réaction et leur influence sur l amplification - Résultats dépendants du milieu réactionnel et de la concentration de chacun des composants - Difficile de prévoir les conditions optimales à l avance mais souvent par tâtonnement - Risque fréquent d amplification parasite ADN - Nécessité d un ADN parfaitement purifié et exempt de protéines et ARN - 5 à 100 ng couramment utilisés 24

25 Enzyme - 1ère utilisée = fragment de Klenow de l ADN pol I mais nombreux inconvénients - Utilisation progressive de la Taq polymérase thermostable (extraite de Thermus aquaticus) - Apparition récente d autres enzymes (polymérases pfu et Vent) plus fiables Nucléotides - Concentrations comprises entre 20 et 200 µm - Concentration équilibrée de chacun des nucléotides (20 µm) 25

26 Amorces et température d hybridation - Nécessité d une Tm des amorces au moins de 5 C au dessus de la t C d hybridation - t C élevée = spécificité de l hybridation (55 à 70 C) - Concentrations de 0,1-0,2 µm - Choix des amorces critique - Etape importante dans la mise au point de la PCR (éviter les épingles à cheveux, hybrides d amorces 5-3, 5-5, 3-3 ) - Composition équilibrée en bases (éviter trop de C-G) - Tm des deux amorces identiques ou très proches 26

27 -Séquences choisies ne doivent pas correspondre à des séquences génomiques répétées - Choix des amorces trop complexe (logiciels disponibles: OLIGO 5, PRIMER 3, PRIMER EXPRESS ) Concentration en ions Mg 2+ - Facteur critique dans l amplification - Rôle dans la stabilisation des nucléotides et la réaction - Concentrations optimales: 0,5 et 2,5 mm (gammes de concentrations) 27

28 Autres composantes de l incubation - ph constant et optimal pour l enzyme - Concentrations optimales de Tp Tris-HCl (10-50 mm; ph 8,3-8,8) - Concentrations en sel capitale [ ] facilite l hybridation et stabilise les hybrides haute force ionique inhibe la polymérase compromis en pratique, utilisation de KCl à 50 mm - Utilisation fréquente de DMSO (10% volume incubation) afin de limiter la formation de structures secondaires (séquences riches en G-C) mais inhibition partielle de la pol 28

29 5. Matériel électronique nécessaire et consommables Thermocycleur Eppendorf Thermocycleur Applied Biosystems 29

30 Thermocycleur Thermo Electron Corp 30

31 Thermocycleurs VWR 31

32 Micropipettes et cones Eppendorf Multipipette Eppendorf 32

33 Tubes 1,5 ml et 0,2 ml Réactifs de réverse transcription et de PCR 33

34 Plaques pour PCR 384 et 96 puits 34

35 6. Limites de la technique PCR -Taille de la séquence à amplifier (>3 kb très difficile!!!...mais idéal jusqu à 1,5 kb) - Nombre de copies de la cible 7. Principaux problèmes rencontrés Contamination - Problème majeur difficile à maîtriser - Apparition de faux positifs et de blancs contaminés ouverture du tube de DNA amplifié et projections de vapeur d eau contenant du DNA solubilisé (contamination de l air, des murs, des sols, du matériel ) projections de fluides corporels (postillons, 35 éternuements )

36 - Limitation des risques par: port de masque, de gants utilisation de cones à filtres travailler rigoureusement sous hotte posséder des pièces spécifiques/étape (sens unique à respecter) pipettes dédiées exclusivement à la PCR décontamination régulière des pipettes (ex: RNAse/DNAse Away) Manque de fidélité de la Taq polymérase - Taux d erreurs important car pas d activité de correction des épreuves (10-4 ) - Pas trop grave si analyse seule du produit amplifié 36 - Très gênant si analyse de mutat o, étude liaisons DNA-prot

37 Amplifications parasites - Possibilité d hybridation non spécifique car amorces courtes - Environ 1% des amorces s hybrident en bonne position - 99% restants s hybrident n importe où - Amplifications non prévisibles et dépendantes des amorces - Augmentation de la stringence ( t C) pour accroître la spécificité de l hybridation 37

38 8. La PCR en temps réel (real-time PCR) - Technique mesurant de façon très précise la quantité initiale de la cible - Sensibilité détectant un faible nombre de copies (ex: mesure charge virale, mesure du % OGM dans un aliment, mesure des variations d expression génique ) - Permet de travailler avec des échantillons en très faible quantité (biopsies, amplifications à partir d une seule cellule) 38

39 - Visualisation de la phase exponentielle de la réaction - Emploi d un fluorochrome spécifique à l ADN - Emploi d une sonde oligonucléotidique fluorescente spécifique à une séquence - Quantification temps réel plus fiable que PCR conventionnelle les agents intercalants - Fluorochrome spécifique ADN double brin nouvellement synthétisé - Le plus utilisé: SYBR Green I - Emission d un signal de fluorescence sous excitation UV - Quantification ADN double brin - Méthode très sensible et reproductible, assez peu onéreuse 39

40 les sondes d hydrolyse ou sondes TaqMan - Sonde fluorogénique spécifique à la séquence que l on souhaite quantifier - Accrochage de la sonde à la séquence à l hybridation - Pas de fluorescence émise par «quenching» - Phase d élongation: la Taq polymérase hydrolyse en clivant «reporter» et «quencher» - Signal détectable dans la longueur d onde du «reporter» 40

41 Fonctionnement de la PCR en temps réel avec sonde TaqMan 41

42 Profil type d une courbe PCR temps réel où le nombre de copies est fonction du nombre de cycles 42

43 Les différents domaines d application de la PCR 43

44 Analyse de l expression génique: 1 ère application en nombre de tests - mesure de l activité d un gène sous des conditions spécifiques (maladie, drogue, stress ) - mesure de l expression des oncogènes (oncologie) Détection et quantification des microorganismes et pathogènes: - détection de bactéries dans les eaux (légionelles ) - détection de pathogènes dans les aliments: suivi sanitaire des chaînes de fabrication (Salmonella, Listeria, E. coli ) - titration de virus (VIH1 et VIH2, VHB, VHC) en phase précoce de la maladie ou suivi des traitements antiviraux Etude des polymorphismes de l ADN: - génotypage de populations/discrimination allélique, 44 identification des mutations

45 Exercices Voir polycopié joint 45