MICROBIOLOGIE GENERALE

Transcription

1 Cours et TP de microbiologie générale MICROBIOLOGIE GENERALE AM Davila, M Naïtali et C Tinsley 1 ère année 2014/2015 Cours/TP Demi promo A Demi promo B Cours 1 11 sept 11 sept Cours 2 11 sept 11 sept TP 1 18 sept 12 sept TP 2 19 sept 13 sept TP 3 20 sept 16 sept Cours 3 26 sept 26 sept Cours 4 27 sept 27 sept 2 salles de TP (CBAI, Bioger) Blouse en coton si possible, cheveux attachés Enseignement du bloc «Sciences de la Vie et du Milieu». Pré-requis : bases solides en biologie générale, biochimie, génétique et biologie moléculaire. Objectifs du cours de microbiologie Bases qui seront utilisées dans d autres parties du tronc commun et dans les modules intégratifs. Structures, génétique, métabolisme et physiologie. Interactions avec les autres composants de la biosphère (biotiques et abiotiques). Rôle dans l équilibre écologique de la planète. Importance dans les activités humaines. Objectifs des TP de microbiologie Mettre en pratique quelques unes des principales méthodes expérimentales utilisées en microbiologie. Etude d un transfert génétique entre bactéries (conjugaison). Identification d une souche bactérienne, étude de sa morphologie et de son métabolisme. Principales références utilisées Physiologie de la cellule bactérienne : une approche moléculaire FC Neidhardt, JL Ingraham, M Schaechter Cours de microbiologie générale A Meyer, J Deiana, A Bernard Microbiologie LM Prescott, JP Harley, DA Klein Molecular genetics of bacteria L Snyder et W Champness Microbial ecology R Atlas et R Bartha Bacterial metabolism G Gottschalk Microbiology webbed out T Paustian et U Wisconsin Microbes-edu.org 1

2 Programme du cours Classification des organismes cellulaires Introduction Spécificités génétiques des procaryotes Métabolisme des procaryotes Ecologie microbienne Le monde microbien et les activités humaines EUCARYOTES Domaine de la microbiologie PROCARYOTES ANIMAUX PLANTES PROTISTES FUNGI micro-algues protozoaires levures moisissures EUBACTERIES ARCHAE Grandes caractéristiques du monde microbien Petite taille Invisibilité Possibilité de dissémination Rapport surface/volume élevé, capacités d échange élevées Simplicité des structures cellulaires Diversité morphologique Diversité taxonomique Diversité physiologique et métabolique Méthodes expérimentales Illustrées dans les travaux pratiques Etude des individus isolés : difficile Observations microscopiques (photonique, électronique, après ou non coloration ou marquage) Cytométrie de flux (auto-fluorescence, gfp, marqueur de viabilité) Etude sans culture préalable Etude après propagation : souvent nécessaire Techniques de culture, d isolement et de dénombrement Techniques de manipulation aseptique 2

3 Classification des organismes cellulaires Arbre phylogénétique de Woese Programme du cours Bactéries à Gram - Introduction Morphologie bactérienne (taille, forme, arrangement) Structures des cellules bactériennes Spécificités génétiques des procaryotes Métabolisme des procaryotes Ecologie microbienne Le monde microbien et les activités humaines Firmicutes (Gram + à bas % G+C) Actinobactéries (Gram + à haut % G+C) Taille des microorganismes Forme et arrangement des microorganismes entre eux Spirochètes 0,2 à 0,7 x 5 à 500 µm Protozoaires Cellules sanguines Levures 1 mm 10 µm Forme sphérique - diplocoques (b) - streptocoques (a) - tétrades (c) - sarcines (d) - staphylocoques (e) coque Escherichia coli 0,5 x 2 à 3 µm Bactéries P = g, d=1 1 µm Filtration stérilisante Forme en bâtonnet bacille vibrion Forme hélicoïdale ou vibroïde Mycoplasma pneumoniae 0,1 µm Virus 0,01 µm Forme spiralée spirille spirochète Forme mycénienne mycobactérie actinomycète 3

4 Neisseria gonorrhoeae Lactococcus lactis Streptococcus thermophilus Les bacilles et vibrions E coli Clostridium Pseudomonas Salmonella Staphylococcus Vibrio Les coques Lactobacillus Listeria Bacillus des streptocoques Les formes spiralées spirochète Campylobacter jejuni Les formes hélicoïdales Helicobacter pilori Treponema pallidum Borrelia burgdorferi 4

5 Les formes mycéniennes actinomycète Programme du cours Introduction Morphologie bactérienne (taille, forme, arrangement) Structures des cellules bactériennes Spécificités génétiques des procaryotes Métabolisme des procaryotes Ecologie microbienne Le monde microbien et les activités humaines Propionibacterium Des éléments constants et d autres non La cellule procaryote La paroi bactérienne Enveloppe caractéristique des procaryotes Barrière à la diffusion de certaines molécules Résistance à la pression osmotique (5 à 20 atm) Forme (exosquelette) Cytosquelette de B. subtilis Sphéroplaste d E. coli Protéines MreB, cytoplasmiques, analogues aux filaments d actine des cellules eucaryotes 5

6 Coloration de Gram Lactobacillus sp. Paroi des bactéries à Gram positif Bactéries à Gram positif (firmicutes, actinobactéries) (20 à 80 nm) à Gram négatif (protéobactéries) Paroi des bactéries à Gram négatif (enveloppes cellulaires) Escherichia coli Caractéristique constante dans un genre donné Différence de structure Différence de composition chimique (8 à 15 nm) (5 à 8 nm) (1 à 3 nm) Le peptidoglycane une structure constante mucopeptide ou muréine ou mucocomplexe / DAP NAG : N-acétylglucosamine NAM : acide N-acétylmuramique DAP : Acide mésodiaminopimélique liaisons glycosidiques ß1-4 entre NAM et NAG ordre invariable des acides aminés du tétrapeptide (pentapeptide) existence des formes D des acides aminés pontage entre la D-alanine et L-lysine Pontage entre la D-alanine et L-lysine direct ou par des ponts inter-peptidiques 6

7 Coloration de Gram Gram positive Gram negative G : N-acétylglucosamine M : acide N-acétylmuramique La paroi des bactéries à Gram positif Les enveloppes cellulaires des bactéries à Gram négatif Acide teïchoique = déterminant antigénique charge de surface adhésion, récepteur Porines (protéines majeures) = diffusion des molécules < 600 Da Autres protéines (protéines mineures) = transport des molécules > 600 Da LPS et phospholipides = diffusion des molécules hydrophobes 7

8 Le LPS : une endotoxine Espace périplasmique Significatif chez les bactéries à Gram négatif Contient des protéines différentes de celles du cytoplasme Antigène somatique Charge de surface Elles sont impliquées dans des fonctions variées Transport de molécules Dégradation de molécules Mobilité (présence de chimiorécepteurs) Toxine, Pouvoir pathogène Membrane plasmique Particularités de la membrane cytoplasmique des procaryotes (/ eucaryotes) Protéine extrinsèque Protéine intrinsèque Bicouche lipidique - Modèle de la mosaïque fluide - Composition variable Rôle de barrière sélective : Transfert de substances, production d énergie Structurales Pas de stérols (sauf chez les mycoplasmes) mais parfois des hopanoïdes Plus de protéines Fonctionnelles Respiration : déshydrogénases, coenzymes, ATPase Photosynthèse : pigments antennaires et centres réactionnels Synthèse d éléments de la paroi et des pili Assemblage et sécrétion de protéines membranaires et des exo-protéines Mobilité : structure basale des flagelles Réception de messages chimiques : chimiotaxie et régulation du métabolisme 8

9 Des invaginations de la membrane La cellule procaryote Le mésosome : Une structure particulière des bactéries à Gram positif, un artéfact, un rôle dans la duplication? Augmentation de la surface : activité respiratoire intense, photosynthèse Protoplaste 70 % d eau siège de la plupart des fonctions métaboliques Bacillus Nitrosomonas Les ribosomes bactériens Une grande similarité avec ceux des eucaryotes Les ribosomes bactériens Une grande similarité avec ceux des eucaryotes Synthèse des protéines Ribosomes mrna 9

10 Le chromosome bactérien 1 seul chromosome, circulaire Super-enroulé. Le nucléoïde bactérien E. coli PM : MDa Paires de bases: kb Taille : µm P. aeruginosa kb C. jejuni kb x µm = 2x MDa = 3x kb Les plasmides La cellule procaryote Production de bactériocines, métabolisme, virulence, résistance - par conjugaison Tansfert par plasmides conjugatifs => pili sexuels - par transduction bactériophage - par transformation plasmide du milieu vers bactérie compétente - bactériocines E. coli -> cole1 -> colicine Bactéries lactiques - métabolisme Pseudomonas -> TOL Pseudomonas -> CAM E. coli, Salmonella -> LAC - virulence E. coli -> K88 -> antigène d adhérence S. aureus -> pza10 -> entérotoxine B - résistance E. coli -> R100 -> antibiotiques, métaux Réserves Carbone Soufre Phosphore bactérie sulfureuse pourpre 10

11 Rôle dans la virulence Zéaxanthine Des pigments bactériens Pyocyanine, Pyoverdine Pseudomonas aeruginosa Transport du fer, active la croissance, létal pour certaines bactéries Pep = chaîne aminopeptidique Staphylococcus aureus Empêche l action des neutrophiles, action anti-oxydante Substance organique visqueuse définie -> capsule diffuse -> glycocalix Structure non indispensable - hydrolyse - mutation - milieu Protection des bactéries - agent chimique - protozoaires - phagocytose Pouvoir pathogène - adhésion à l épithélium - empêche les défenses de l hôte Support de l antigénicité Spécificité sérologique Pathogénicité de Streptococcus pneumoniae Des capsules au service de l homme Dextrane Leuconostoc mesenteroides => gélifiant Xanthane Xanthomonas campestris => émulsifiant => lubrifiant 11

12 Flagelles Composés principalement de flagelline (protéine). Sous-unités en hélice. Antigène H Nage 40 à 60 révolution/s 20 à 90 µm/s Nécessite un gradient de protons (force proton-motrice) Chimiotactisme, aérotactisme, phototactisme, magnétotactisme Aérotactisme d E. coli course - culbute - course Type de Flagelles Monotriche (unipolaire) Lophotriche (unipolaire) Amphitriche (bipolaire) Péritriche Exemple Vibrio cholerae Pseudomonas aeruginosa Campylobacter Escherichia coli Pili : pilus sexuel Pili : pili communs ou fimbriae Bien d autres structures pour des fonctions variées Protéines de surfaces S-layer : squelette externe, adhésion, résistance aux protéases des macrophages Bactéries à Gram + : pas de liaison covalente avec la muréine Bactéries à Gram - : couche S ancrée au LPS Transfert de matériel génétique entre deux bactéries Propriétés antigéniques Adhésion aux surfaces inertes ou aux cellules (formation de biofilm, facteur de virulence) Récepteurs (bactériophages) Locomotion Rares chez les gram +, fréquents chez les gram - Essentiellement constitués de protéines, pilines et adhésines. Arrangement en cylindre droit 12

13 Les spores Des formes de résistance bactérienne Bacillus, Clostridium Structure Dipicolinate de calcium 10 à 20%, peptidoglycane inhabituel Milieu favorable Milieu défavorable DNA très imperméable peptidoglycane normal -> future paroi Spore dormante DNA patrimoine génétique de la cellule végétative future membrane Sporange très imperméable cytoplasme La sporulation De l ordre de 10 h chez Bacillus Activation Germination des spores Lever la dormance : Procédés mécaniques, physiques, chimiques Initiation : Conditions favorables (hydratation, métabolites effecteurs) Processus autolytique : Destruction du peptidoglycane sporal et libération du dipicolinate de calcium => La spore s'imbibe d'eau Excroissance Emergence d'une nouvelle cellule végétative. Phase active de biosynthèse (protéines) Propriétés des spores Thermorésistance résiste 20 min à 80 C, détruit à 121 C Varie d une espèce à l autre, d un milieu à l autre Vapeur Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 et 12980, CIP 5281 Chaleur sèche Bacillus atrophaeus ATCC 9372, CIP 7718 Résistance aux agents physico-chimiques - rayons UV, X - ionisation Bacillus pumilus ATCC 27142, CIP hautes pressions - agents antiseptiques - désinfectants Oxyde d éthylène Bacillus atrophaeus ATCC 9372, CIP 7718 Action - du dipicolinate de calcium - de l'état déshydraté (15 et 20 % p/p) - de l'imperméabilité des enveloppes - de protéines qui saturent l ADN et le protège - d enzymes de réparation de l ADN 13