Spectrométrie de masse

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1 Analyse structurale Activation par collision AB + Gaz de collision (Ar, N 2 ) A + Energie du centre de masse Energie cinetique de l ion definit selon l echelle du laboratoire (potentiel d acceleration) Pompe turbomoléculaire AB + + N AB + * + N A + + B + N E CM = E Lab m AB m + N m N La collision de AB+ avec un gaz neutre N occasionne un augmentation d énergie interne du précurseur (AB +* ). Cette énergie interne est dissipée dans les oscillateurs de l ion et favorise sa fragmentation lorsque celle-ci est supérieure à celle des liens covalents. On distingue les collisions de basse énergie (E Lab <200eV) pour les appareils quadrupolaire, trappe ionique, ICR et les hautes énergies (E Lab >kev) pour les secteurs et TOF. 1

2 Analyse structurale Activation par collision Les ions analysés par les filtres quadrupolaires ont une énergie cinétique < 10eV. L augmentation d énergie interne survient lors de collisions successives avec le gaz cible. L augmentation d énergie cinetique ou l augmentation de la masse du gaz cible augmentera l énergie disponible. L augmentation de la masse de l ion (simplement chargé) diminuera l énergie disponible selon 1/m AB. 2

3 Analyse structurale Caractéristiques du spectre MS-MS de peptide Ions fragments immonium caractéristiques de la composition peptidique Ions fragments caractéristiques de la séquence peptidique Chem. Rev. 2001, 101,

4 Analyse structurale Ions immoniums Ions d abondance significative Chem. Rev. 2001, 101,

5 Analyse structurale Fragmentation de peptide Fragments observés x 8 y 8 z 8 Charge localisée sur le fragment C term R 1 R 2 R 9 NH 2 - CH - CO-NH-CH-CO----NHCHCOOH Charge localisée sur le fragment N term a 1 b 1 c 1 Numérotation debute avec acide aminé N term Nomenclature: Roepstorff, Fohlman, Biomed. Mass Spectrom., 11, 601 (1984) Biemann, Biomed Env. Mass Spectrom., 16, 99 (1988) Fragments typiquement observés en basse énergie sont ceux correspondant au bris du lien peptidique b (et la perte de carbonyl: a) et y Voir aussi: 5

6 Analyse structurale Mécanisme de fragmentation Formation de paires d ions complementaires selon une dissociation induite par la charge. Protonation du lien amide et autres acides aminés. Scission du lien peptidique et retention de la charge sur fragment N term (A). Scission du lien peptidique et retention de la charge sur fragment C term (C). Anal. Chem. 1993, 65,

7 Analyse structurale Mécanisme de fragmentation Formation de d ion y multiplement chargé selon une dissociation éloigné de la charge. Transfert de proton d un acide aminé adjacent et formation d un cycle. Scission du lien peptidique et formation de fragments complementaires (B). Anal. Chem. 1993, 65,

8 Analyse structurale Calculs des m/z de fragment x 8 y 8 z 8 Charge localisée sur le fragment C term R 1 R 2 R 9 NH 2 - CH - CO-NH-CH-CO----NHCHCOOH Charge localisée sur le fragment N term a 1 b 1 c 1 Numérotation debute avec acide aminé Nterm y 1 = (masse AA 9 ) + 19 b 1 = (masse AA 1 ) + 1 y 2 = y 1 + (masse AA 8 ) b 2 = b 1 + (masse AA 2 ) y 3 = y 2 + (masse AA 7 ) b 3 = b 2 + (masse AA 3 ) Dernier y = MH + Dernier b = MH (H 2 O) X n-1 = y n (CO-2H) a n = b n -28 (CO) z n = y n -17 c n-1 = b n (NH 3 ) 8

9 Analyse structurale Calculs des m/z de fragment Exercise Spectre MS-MS de m/z (Leu-enkephaline) 9

10 Identification de protéine intacte par ICR- MS-MS de la protéine phospho carrier de Mycoplasma pneumonia en utilisant l activation laser IRMPD (infra-red multi photon dissociation) mettant en évidence une sérine phosphorylée Nat. Biotech., 19, 952 (2001) 10

11 Identification de protéine Approche protéomique L identification de protéine intacte à partir de fragmentation d ions multiplement chargés est limitée par: Résolution du MS pour l identification de la masse et de la charge des fragments. L accroissement d énergie interne lors de l activation. Nombre d oscillateur augmente avec M L observation d ion fragments distribués uniformément le long de la chaine peptidique. Il est plus pratique générer de plus petits peptides obtenues lors de la digestion protéolytique 11

12 Identification de protéine Approche protéomique Site Remarque Réactif chimique Bromure de cyanogène C term Met Homosérine 30.1 Da Homosérine lactone 48.1 Da BNPS-skatole C term Trp Hydrolyse acide Asp/Pro Aléatoire par la suite Endopeptidases -NH-CH-CO-NH-CHR-CO Trypsine C term Lys/Arg CH 2 CH Endoprotéinase Lys-C C term Lys 2 S Endoprotéinase Asp-N avant C term Asp CH 2 -NH-CH-CO Endoprotéinase Arg-C C term Arg CH O 2 CH Chymotrypsine C term Phe/Trp/Tyr/Leu 2 Pepsine C term Phe/Trp/Tyr/Leu Milieu acide Thermolysine avant Leu/Ile/Met/Phe/Trp -NH-CH-COOH CH 2 CH 2 OH Homoserine/lactone De façon générale on préfère l utilisation de trypsine car elle est active sur gel et produit des peptides trypsiques ayant un acide aminé basique au C term facilitant la fragmentation en MS-MS Voir aussi: 12

13 Identification de protéine Approche protéomique Séquençage par MS-MS LC/MS/MS Act. Coll. A B C K/R B C K/R C K/R K/R Echelle de fragments Ident. ambigüe Recherche de base de donnée Reduction/alkylation/ Digestion trypsique Recherche de base de donnée Identification de protéine Empreinte de masse Identification satisfaisante ETR FVTK ASENGSDNFGDITSK YA GGVK TEK EK SVGVGLR VYF Peptide trypsique uniques pour chaque proteines (SDS-PAGE ou gel 2D) MALDI-TOF Mesure de masse 13

14 Identification de protéine Approche protéomique ERA May-2001 EGF Chall, 10 ul zip tip nadiene May 10/01 spot 17 AEGF10E (0.040) Cm (1:12) Sensitivity >15:1 Laser Energy = 40 Pulse Voltage = 3150 Detector Voltage = : TOF LD+ 1.26e ATP synthetase D chain % Autolyse trypsine Variation genetique m/z

15 Identification de protéine Approche protéomique Duty cycle 2s MSMS 2 1s survey 2s MSMS (1+) (2+) T (2+) (2+) (1+) Survey scan Time (min) m/z m/z MS-MS scan K S F N N N E E I A ymax K Q I E E L S LD ymax Human Stathmin m/z 15

16 Identification de protéine Approche protéomique Précurseur: m/z (2+) peptide trypsique Etape 1: Trouver les fragments adjacents séparés par un AA Etape 2: Dernier fragment de séquence (1082.8) Etape 3: identifier série de fragments Si est un fragment y alors =200, combinaison possible: (EA), (SL ou SI). Si est un fragment b = (aucun AA),

17 Identification de protéine Approche protéomique Précurseur: m/z (2+) Etape 4: Identifier les fragments adjacents espacés par un AA. Etape 5: Assigner les AA correspondants P-K/Q Etape 6: AA manquant: y 2 = 244 = AA : P-K/Q alors que 227 correspond a (AH) et n est pas trypsique (K/R) N S L/I P F E P V P

18 Identification de protéine Approche protéomique Précurseur: m/z (2+) EAAPEFPLSPPK Stathmin N S L/I P F E P A P

19 Identification de protéine Approche protéomique Exercise MS-MS de m/z (3+) IHGFDLAAINLQR Lactoperoxidase bovine

20 Analyse de glycoprotéines Different types de Hyl: 5-hydroxylysine glycosylation Oligosaccharide lié à l Asn (N-linked) Oligosaccharide lié à Ser ou Thr (O-linked) Oligosaccharide (glycosylphophatidyl inositol) lié au C term Chemical Reviews, 1996, Vol. 96, No

21 Analyse de glycoprotéines Différent types de glycosylation 21

22 Analyse de glycoprotéines Différent types de glycosylation 22

23 Analyse de glycoprotéines Différent types de glycosylation Consensus de glycosylation à l Asn 23

24 Analyse de glycoprotéines Glycosylation à l Asn Chemical Reviews, 1996, Vol. 96, No

25 Analyse de glycoproteines Glycosylation à l Asn Adapté d après \kornfeld et Kornfeld, Ann. Rev. Biochem., 54, 631 (1985) 25

26 Analyse de glycoproteines Glycosylation aux Ser/Thr Chemical Reviews, 1996, Vol. 96, No

27 Analyse de glycoproteines Glycosidases 27

28 Analyse de glycoproteines Analyse par MS-MS Liens glycosidiques sont plus labiles que les liens peptidiques Fragmentation des liens glycosidiques occasionne la formation d ions oxoniums stables et diagnostiques de la composition en monosaccharide 28

29 Analyse de glycoproteines Analyse par MS-MS Protein Science (1993), 2,

30 Analyse de glycoproteines Analyse par MS-MS LC-MS de digest trysique de fétuine GlcNac Gal Neu5Ac J. Anacleto et al., Proc. 43 rd ASMS, 1996, p

31 Analyse de glycoprotéines Analyse par CE-MS m/z 163, 204 (OR: 100V) m/z (OR 30 V) Digest trypsique de lectine Phaseolus vulgaris (700 fmoles inj., 1.0 M formic acid, EO anodique 23 kv) c) m/z T GlcNAc 2 Man 5-9 Séparation de glycoformes Temps (min) Bateman et al., CE of carbohydrates, Humana Press p. 219, (2003) 31

32 Analyse de glycoproteines Analyse par MS-MS Fragmentation typique des oligosaccharides en MS-MS à basse energie collisionnelle 32

33 Analyse de glycopeptide par MS-MS MS-MS m/z 1314 a [GlcNAc 1 Man 6 +H] + b [GlcNAc 1 Man 5 +H] + c [GlcNAc 1 Man 4 +H] + d [GlcNAc 1 Man 3 +H] + e [GlcNAc 1 Man 2 +H] + f [GlcNAc 1 Man 1 +H] Hex Hex Hex Hex Hex Hex e d 990 c b f m/z [M+2H] 2+ [Peptide-GlcNAc+2H] 2+ [Peptide-GlcNAc+H] a Bateman et al., CE of carbohydrates, Humana Press p. 219, (2003) 33

34 Analyse de glycopeptide par MS-MS Asn n + Act. Coll. n-1 + n Act. + Coll. Forme en source avec V OR Fragment peptidique 100 Gln Leu/Ile Leu/Ile Leu/Ile Asn Thr Glu Asn Phe GlcNAc 75 GlcNAc FNETNLILQR m/z Bateman et al., CE of carbohydrates, Humana Press p. 219, (2003) 34

35 Autres types de modifications post-traductionelles 35