Etude de l organisation spatiale de territoires chromosomiques dans le noyau trisomique 21

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1 Etude de l organisation spatiale de territoires chromosomiques dans le noyau trisomique 21 MASTER 1 présenté le 16/09/2014 Par Natasha OLLIER Maître de stage : Stéphan KEMENY Chef de Service : Philippe VAGO Département de Cytologie Histologie Embryologie Cytogénétique Faculté de Médecine Université d Auvergne Service de Cytogénétique Médicale CHU Estaing Clermont-Ferrand

2 Trisomie 21 Maladie génétique 47,XX,+21 Expressivitévariable Traits «constants»: - déficience intellectuelle - hypotonie musculaire -laxitéarticulaire - dysmorphie Traits «inconstants»: - malformations cardiaques et digestives - incidence (-) des cancers mammaires - pathologies auto-immunes -épilepsie -

3 Gènes impliqués dans la trisomie 21? Hypothèse 1 :«Gene dosage effect» Surexpression des gènes de la région critique du syndrome de Down (DSCR), comprise de 21q22.1 à 21q22.3 Mao et al, 2005 Hypothèse 2 : «Developmental instability hypothesis» Dérégulation transcriptionnelle secondaire et globale de nombreux gènes diploïdes situés sur les autres chromosomes Chou et al, 2008

4 Régulation du génome Corrélation activitétranscriptionnelle et disposition des gènes dans le noyau Activité àl intérieur du noyau Kosak et al Corrélation activitétranscriptionnelle et disposition des gènes à l intérieur du TC Activité àla surface des TC (boucles) Cremer et al. 2001

5 Distribution des TC Disposition radiale par rapport au centre du noyau Mécanismes? Taille, densitéen gènes, «densitéen gènes / taille» Heride et al Activité cellulaire (Nb genes /Mb 2 ) Bridger et al Proximité spatiale préférentielle Bolzer et al Zeitz et al. 2009

6 Objectifs Etude de l organisation spatiale de TC dans le noyau T21 FISH-3D Microscopie confocale Logiciel Imaris Données T21 / Contrôle - volume nucléaire -volume TC 18, 19, 21 -position radiale TC 18, 19, 21

7 Matériel Cellules de VillositéChoriales 2 populations : -T21 (n = 2) -Contrôle (n = 2) Cultures cellulaires cryoconservées Dérégulation de nombreux gènes en cas de T21 Altug-Teber et al. 2007; Rozovski et al Disposition radiale des TC jamais explorée

8 ❶FISH-3D (1) Préparation de LIS Maintien des cellules en culture

9 ❶FISH-3D (2) Protocole de FISH-3D 1/ Fixation cellulaire Fixateur: PFA Triton 0,01% / Triton 0,5% / Glycérol 2/ Perméabilisation cellulaire Azote / HCl / HCl + Pepsine / SSC Formamide 3/ Dénaturation -Hybridation des sondes 6 mélanges de 2 sondes WCPs : 12 TC (1-17/ 18-19/ 3-22/ 4-21/ 6-8/ 7-10) 4/ Lavages -Contre-coloration au DAPI Vérification hybridation microscope àfluorescence

10 ❷Microscopie confocale Acquisition des images Microscope confocal (Leica SPE) objectif àimmersion X63 ~ 30 noyaux / TC ~ 40 coupes optiques / noyau, Z-stack = ~ 0,3 µm Logiciel LAS-AF

11 ❸Logiciel Imaris 2/ Traitement des images 1/ Volumes noyaux et TC 2/ Centre de masse du noyau et des TC

12 Résultats «techniques» 1/ FISH-3D 2/ Analyse confocale 3/ Traitement Imaris 4/ Comparaison données (Contrôle / T21)

13 Résultats 1/ FISH-3D 48 LIS réalisées Mauvaise hybridation Manque de noyaux 31 LIS hybridées 2/ Microscopie confocale Durée variable (~ 2h / lame) Résolution (Nb noyaux) Hybridation

14 Résultats 3/ Traitement Imaris 1/ Mesure volumes noyaux / TC 2/ Mesure distances intranucléaires

15 Résultats 4/ Comparaison données (Contrôle / T21) T21 (n = 2) Contrôle (n = 2) Noyaux N = 562 Noyaux N = 517

16 Résultats 4/ Comparaison données (Contrôle / T21) T21 (n = 1) Contrôle (n = 1) TC 21 N (T21) = 33 N (C) = 73 TC 21 TC 19 N (T21) N (T21) = 33= 22 N (C) N = (C) 73= 30 TC 18 N (T21) = 24 N (C) = 44

17 Résultats 4/ Comparaison données (Contrôle / T21) T21 (n = 1) Contrôle (n = 1) TC 21 N (T21) = 33 N (C) = 59 TC 19 N (T21) = 22 N (C) = 30 TC 18 N (T21) = 24 N (C) = 44

18 Conclusion / Discussion FISH-3D, Confocal, Imaris Différences avec FISH-2D +++ Difficultés hybridation Données Pas de modification du volume nucléaire MAIS modification de l architecture intranucléaire Modification du volume des TC Modification de la position radiale des TC

19 Perspectives Traiter images (Imaris ) des lames déjàacquises pour autres TC Augmenter le nombre de patient Corrélation position TC et expression des gènes

20 Merci de votre attention