Chapitre 16. Immunologie et Western blot

Transcription

1 Chapitre 16 Immunologie et Western blot

2 I Rappels

3 L immunoenzymologie Technique puissante couramment utilisée en recherche et en diagnostic Basée sur la très grande spécificité des anticorps pour leurs antigènes Test qualitatif Détection de protéines après électrophorèse : Western-blot Détection de protéines sur une coupe histologique Test quantitatif Dosage d antigènes Dosage d anticorps LISA (direct, compétitif ) MIT Principe de la réaction complexes Ag-traceur + Ac Ac-Ag-traceur Ag-Ac-traceur Ag + Ac-traceur signal Composé coloré Spectrophotométrie Composé fluorescent fluorimétrie substrat mission de lumière luminescence

4 1. l anticorps primaire Anticorps primaire Anticorps primaire Ag Ag x: Méthode LISA compétition Histologie : immunofluorescence directe spèces chez qui l anticorps primaire peut-être obtenu : souris, lapin, rat, chèvre Isotype IgG 2. l anticorps secondaire Anticorps secondaire Immunoglobuline dirigée contre la partie Fc de l anticorps I et produit chez une autre espèce que cet anticorps I Ag x : Ac I = IgG lapin Ac II = IgG de chèvre anti-igg de lapin

5 Ag Ag Détection du complexe Ag-AcI-AcII Ac secondaire conjugué Avantage du système : amplification du signal 3. Les composés conjugués Les enzymes nzyme d oxydoréduction La peroxydase du raifort («Horseradish peroxydase», HRP) nzymes hydrolytiques Les radio-isotopes Phosphatase alcaline b-galactosidase Principalement l iode-125 et le tritium (H 3 ) Les fluorophores Principalement en microscopie (rhodamine, FITC)

6 4. Le système (strept)avidine-biotine Avidine: glycoprotéine du blanc d œuf ( daltons) Streptavidine : protéine synthétisée par Streptomyces avidinii ( daltons) 4 sites de liaison pour la biotine Biotine : vitamine H Système d amplification des signaux Affinité (strept)avidine-biotine est extrêmement élevée (10-15 M) (supérieur à Ag- Ac: M) B Av B nz nz B B Av B B nz + Substrat Signal Ag Ag Ag Ag

7 Les différentes méthodes Détection Western blot, immunohistochimie Antigène Phase hétérogène Dosage LISA compétition Immunométrique (LISA sandwich) Phase homogène Dosage MIT (nzymes Multiplied Immunoassay Technique Anticorps Phase hétérogène Dosage Immunométrique de type LISA

8 Phase hétérogène: l étape de blocage (saturation) Les supports physiques utilisés ont une affinité élevée pour les protéines Dépôt d antigène Dépôt d anticorps Plaque LISA Membrane nitrocellulose Les protéines adsorbées sur le support n occupent qu une petite fraction de la surface Nécessité d occuper l espace afin d éviter des fixations non spécifiques d anticorps et/ou d antigènes Sérum Albumine Lait en poudre Collagène Ac II Ac I Ag Détergent doux (tween20) Protéines inertes

9 From Molecular Cell Biology by Harvey Lodish et al. Détection d antigène: Western-blot Détection de protéines Détermination du poids moléculaire tape 1: séparation des protéines selon leur poids moléculaire SDS-PAG : Sodium Dodécylsulfate- PolyAcrylamide Gel lectrophoresis

10 tape 2: Transfert des protéines sur un support solide (membrane de nitrocellulose)

11 /ch331/techniques/techlectrophoresis.htm tape 3: Incubation avec les anticorps et révélation From Molecular Cell Biology by Harvey Lodish et al.

12 Révélation colorimétrique de bandelettes Révélation par émission de lumière et impression de films photographiques : lectrochemiluminescence (CL)

13 Intensité signal Dosage d antigènes en phase hétérogène 1. Méthode LISA compétition (nzyme Linked Immunosorbent Assay) Compétition à l Ag marqué Ag recherché de petite taille (hormones, médicaments) Ac I fixé Ag marqué (quantité fixe) Ag à doser (non marqué; quantité variable) Réalisation d une courbe d étalonnage avec des solutions d Ag de concentrations connues Courbe d étalonnage Dosage avec le sérum du patient. Détermination de la concentration d Ag contenu dans le sérum à l aide de la courbe étalon [Ag] non marqué ng/ml

14 Compétition à l Ac marqué Ag fixé Ag à doser (quantité variable) liminés par lavage + Ac marqué (quantité fixe) A l équilibre de la réaction Ag-Ac, l anticorps s est réparti entre l Ag à doser et l Ag fixé Plus l Ag à doser est abondant, moins l Ac marqué peut accéder à la phase solide

15 Intensité signal 2. Dosage immunométrique de type sandwich Ag circulant dans le sérum et divalent (ex: Ag bactériens, viraux, parasitaires) Méthode LISA sandwich (100 fois plus sensible que LISA compétition) + Ag divalent recherché Signal augmente en fonction de la concentration d Ag [Ag] pg/ml + Substrat Signal

16 nz Dosage d antigènes en phase homogène Technique MIT = nzyme Multiplied Immunoassay Technique Méthode de recherche d antigènes de petite taille (drogues, médicaments ) dans les échantillons biologiques (sang, urine ) méthode compétitive et automatisable (couramment utilisée dans les laboratoires de toxicologie) Ag recherché Substrat de l enz Ac + Ag recherché présent Ag recherché absent Signal Dégradation du substrat Signal [Ag] Site catalytique inaccessible Signal inchangé

17 Intensité signal Dosage d anticorps en phase hétérogène 1. Dosage LISA à l antiglobuline marquée (LISA indirect) Sérodiagnostics bactériens, viraux, parasitaires recherche d anticorps dans le sérum de patients suite à une infection ou une vaccination Ag fixé Ac sérique recherché + + Ac secondaire marqué + Substrat Signal [Ac]

18 2. Recherche des IgM spécifiques d un Ag donné Immunocapture des IgM totales IgM non spécifique Ag Ag + Substrat Signal IgM spécifique

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20 II xemple Dosage des antigènes et des anticorps

21 Sériodiagnostic du VIH

22 Protéine d enveloppe gp120 et gp41 (précurseur gp160) Gène env Protéine de nucléocapside p24 Gène gag Cinétique de détection des marqueurs de l infection VIH Protéine de Transcriptase inverse p32, p55, p65 Gène pol

23 Le sérodiagnostic de l infection à VIH Test LISA (en première intention) Western-blot (en confirmation d une séropositivité VIH) Test LISA sandwich (LISA de 3ème génération) Test LISA de 4ème génération VIDAS HIV DUO ULTRA (Biomérieux) Ag VIH Ac anti-vih recherché Ac antip24 fixé Ag p24 nz + substrat Ag VIH marqué Ac anti-p24 marqué nz Signal [Ac anti VIH] (IgG et IgM) Ag VIH Ag VIH marqué Ac anti-vih

24 Western-blot Mise en évidence des Ac anti-vih du patient 1. Séparation des protéines virales par SDS-PAG 2. Transfert sur bandelette de nitrocellulose 3. Incubation avec le sérum du patient 4. Révélation avec un anticorps anti-igg humain marqué La présence de bandes révèle l existence d anticorps dirigés contre des Ag du VIH dans le sérum du patient Positif si reconnaissance de gp160, gp120 et au moins une protéine pol (p32, p65 ou p55) ou une protéine gag (p24 ou p18)

25 Bandelette positive Bandelette négative