Module de biologie moléculaire

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1 Master Reproduction et Développement, Master génétique septembre Module de biologie moléculaire Marie Baron Alban Bouquet Responsable du module : Bellier Sylvain. Laboratoire de Génétique Moléculaire et Cellulaire, UMR 955 INRA-ENVA. 1

2 Introduction...page 3. TP1 - Mise en évidence du phénomène de Silencing par RT-PCR quantitative.....page 4. Principe de la technique...page 5. Contexte expérimental......page 5. Matériel et méthodes page 5. Résultats......page 9. Conclusion......page 11. Bibliographie page 13. TP2 - Mise en évidence du rôle des protéines chaperonnes par transfection cellulaire...page 14. Principe de la technique page 14. Contexte expérimental page 14. Matériel et méthodes page 15. Résultats......page 17. Discussion.....page 18. Conclusion......page 19. Bibliographie page 19. TP3 - Utilisation de la PCR nichée pour l identification des Bartonnelles page 20. Principe de la technique page 20. Contexte expérimental page 20. Matériel et méthodes page 21. Résultats......page 21. Bibliographie..page 22. TP4 - PCR et typages moléculaires des salmonelles page 23. Principe de la technique page 23. Contexte expérimental page 23. Matériel et méthodes page 24. Résultats......page 24. Conclusion......page 25. Bibliographie...page 25. Conclusion/Remerciements...page 25. 2

3 Introduction : L objectif de ce module est de présenter et d apprendre à utiliser les principaux outils de la biologie moléculaire et qui sont actuellement les plus fréquemment utilisés dans les laboratoires. Les techniques qui ont été abordées sont : la PCR quantitative en temps réel, la transfection de cellules, la migration sur gel d électrophorèse, la PCR nichée et la bactériologie. Toutes ces techniques sont présentées dans un contexte d étude, ce qui permet d être informés des récentes découvertes et des tendances actuelles dans la recherche en biologie moléculaire, en plus d apprendre la théorie et la manipulation des outils. Afin de compléter nos connaissances, une bibliographie des sujets de recherche et sur les techniques nous a été fournie. Les enseignants présents étaient : Sylvain Bellier (UMR 955 INRA-ENVA de Génétique Moléculaire et Cellulaire) qui dirigeait le module, Sylvie Lecollinet, doctorante à l UMR 1161 de virologie ENVA/INRA/AFSSA, sur le sujet : Bases moléculaires de l'interaction entre les adénovirus vecteurs vaccinaux et la muqueuse intestinale. Elle a encadré le TP 1 : Mise en évidence du phénomène de Silencing par RT-PCR quantitative. Annemieke Michels, post-doctorante à l ENS/CNRS, en génétique moléculaire (sujet : Regulation of the positive transcription elongation factor P-TEFb by the small nuclear RNA 7SK and the protein MAQ1/HEXIM1). Elle nous a encadré durant le TP2 : Mise en évidence du rôle des protéines chaperonnes par transfection cellulaire. Henri-Jean Boulouis (Dept. Microbiologie UNR 956 ENVA), dont le thème de recherche est l actualité sur les bartonelloses et Martine Montreil (Bactéries pathogènes vectorisées par les arthropodes: exemple de Bartonella) nous ont encadrés durant le TP 3 : Utilisation de la PCR nichée pour l identification des bartonnelles. Enfin Yves Milleman, qui travaille sur la microbiologie des salmonelles (unité épidémiologie et analyse de risque, ENVA), nous a encadré durant le TP 4 : PCR et typages moléculaires des salmonelles. 3

4 TP1 : Mise en évidence du phénomène de Silencing par RT-PCR quantitative Principe de la technique : La Réaction de Polymérisation en Chaîne a pour but d amplifier une séquence génomique d intérêt. Le principe de son fonctionnement est le suivant : Le matériel de départ est un ADN bicaténaire. Les brins sont séparés en chauffant le mélange de réaction : c est la dénaturation. En refroidissant le mélange de réaction, on permet aux amorces de s associer à leurs séquences complémentaires, qui bordent la région à amplifier. La Taq polymérase synthétise de nouveaux brins d ADN complémentaires à la matrice, audelà de la position du site de fixation de l amorce sur l autre brin : c est l élongation. Le mélange de réaction est à nouveau chauffé ; les brins parentaux et néosynthétisés se séparent. Il y a maintenant quatre sites de fixation pour les amorces, un sur chacun des brins parentaux et des brins néosynthétisés. La Taq polymérase synthétise de nouveaux brins complémentaires mais l élongation est cette fois limitée à la séquence que l on désire amplifier. Ces deux chaînes nouvelles représentent exactement la région spécifiée par la position des amorces. Le cycle est répété autant de fois que l on veut. La technique de PCR utilisée dans ce TP se nomme PCR quantitative en temps réel. Le principe est d ajouter au milieu de réaction un fluorochrome (ici, le Sybr Green). C est une molécule intercalante, qui n émet de fluorescence que lorsqu elle est intercalée entre deux paires de bases. Ainsi, le Sybr Green ne fluorescera pas lors de sa mise dans le milieu au lancement de la PCR ; il ne commencera à émettre un signal que lorsqu il sera incorporé dans la synthèse de l ADN double brin. Son taux de fluorescence est donc directement proportionnel à la quantité d ADN formée. Dans notre contexte, les fragments d ADN à répliquer sont très petits (de 100 à 200 nucléotides), afin que l appareil puisse calculer l évolution de la fluorescence en temps réel. L appareil utilisé se nomme Light Cycler et est fabriqué par les laboratoires Roche (Meylan, France). Cet appareil permet d utiliser la chimie des intercalants ou des sondes (méthode TaqMan et test d hybridation et sondes Beacon). La PCR et les analyses quantitatives sont réalisés par l appareil, dans des capillaires, ce qui permet d améliorer la qualité de la mesure et de ne plus avoir à manipuler les échantillons : une fois ceux-ci analysés, ils seront jetés. D autres indicateurs de la quantité d ADN formé peuvent être utilisés. Il s agit du principe du FRET (Fluorochrome Reporter Energy Transfert), où l énergie d un fluorochrome donneur est transférée à un fluorochrome accepteur. Ces deux derniers sont fixés à des sondes, censées s hybrider à quelques paires de bases l une de l autre (1 à 5 nt), la proximité physique des deux fluorochromes permet alors le transfert photonique et donc la fluorescence. La fluorescence est donc émise spécifiquement lors de l amplification du segment chromosomique recherché (pour plus de détails, cf. références bibliographiques). 4

5 Contexte expérimental : La thèse de Melle Lecollinet porte sur l attachement des adénovirus à la surface des cellules épithéliales intestinales. Cette recherche a pour finalité de réussir à utiliser les adénovirus comme vecteurs vaccinaux pour une administration par voie orale. Pour cela, des séquences géniques sont incérées au sein du génome adénoviral et les gènes précoces (e pour early ) du virus sont délétés, afin d éviter une invasion virale. Cette invasion induit une réponse humorale avec synthèse d anticorps. L avantage de ce modèle de virus est qu il induit des réponses immunitaires très fortes et protectrices. Mais l inconvénient de cette méthode est que l administration orale diminue l efficacité de la vaccination. Les adénovirus ne sont pas enveloppés et possèdent un génome à ADN. Certaines espèces sont spécifiques d un organe, comme l adénovirus spécifique à l œil (stéréotype 8) qui produit une kérato-conjonctivite épidémique. Ils présentent une protéine d attachement nommée fibre à leur surface. Pour se fixer à la muqueuse intestinale, l adénovirus doit donc trouver le récepteur et posséder une protéine d attachement. Seulement, leur principal récepteur (nommé CAR pour Cosaki Adenovirus Receptor) est souvent absent de la membrane épithéliale ou inaccessible. Dans cette étude, un modèle in vitro de muqueuse intestinale est recréé. Des échantillons de cellules sont mises en contact avec 3 adénovirus : le stéréotype 5 qui fait partie du sous-groupe C (liaison avec CAR), et les stéréotypes 8 et 35, qui font partie du sousgroupe B. Comme on cherche à n observer que l attachement, on place les cellules à 4 C, afin d éviter l internalisation du virus dans la cellule. Il faut également marquer une partie du virus : soit une de ses protéines, soit une partie de son génome. Ce deuxième type de marquage permet de faire des PCR en temps réel (ou RT-PCR), c est donc celui-ci qui est choisi dans cette étude. Nous cherchons à caractériser la facilité d un adénovirus à franchir la barrière membranaire en présence de la protéine CD46, récepteur cellulaire de virus (comme celui de la rougeole) qui transmet l information aux lymphocytes T par présentation de l antigène (cette molécule a donc pour rôle de fixer les virus, donc de favoriser son attachement), en fonction du type de fibre qu il possède. La quantité d ADN viral présente dans les cellules, après infection, est mesurée par PCR quantitative en temps réel. Cette technique nous permettra d évaluer le nombre de plasmides présents en moyenne par cellule, la faible taille des séquences identificatrices de l ADN viral et cellulaire nous oblige à les amplifier. Pour observer le rôle de la protéine CD46, nous utiliserons deux techniques différentes qui inhibent son effet. La première consiste à introduire l antigène CD46 qui se fixera à CD46 et bloquera son action, la seconde vise à diminuer l expression de CD46 par ARN interférence. L absence de CD46 à la surface de la cellule permettra de conclure sur le rôle de cette protéine pour la transfection virale. Lors d une PCR en temps réel, les fragments d ADN double brin à étudier doivent être très petits (de 100 à 200 nucléotides), sinon l analyse est trop longue pour être en temps réel. De plus, la taille du vecteur est ainsi minimisée car plus le vecteur est gros et moins il sera exprimé car plus vulnérable. L ADN amplifié est révélé par le Sybr Green, molécule dont le taux de fluorescence est proportionnel à la quantité d ADN double-brin formé. Le taux de fluorescence est mesuré en fin d élongation, par un système de diodes contenu dans l appareil à PCR (environ 400 nm), qui excite le fluorochrome via un miroir. Ce système permet de faire l amplification et les analyses en même temps. 5

6 Matériel et méthodes : L appareil utilisé se nomme Light Cycler et est fabriqué par les laboratoires Roche (Meylan, France). Cet appareil permet de réaliser la chimie des intercalants et la chimie des sondes (méthode TaqMan, test d hybridation et sondes Beacon). Les tests sont réalisés en capillaires de verre, ce qui favorise les échanges thermiques et accélère la réaction (une PCR dure moins d une heure). Mais l appareil ne comporte que 32 capillaires, ce qui limite la quantité d échantillons analysés, surtout que chaque mesure doit être effectuée en double. Cet appareil est muni d un système propulsé qui permet de modifier rapidement la température du milieu de réaction. 1) Préparation du mix PCR dans le cooling block : Le mix est le milieu de réaction de la PCR quantitative en temps réel. Il se compose : - D amorces (ou primers) Forward, qui se fixent sur le brin d ADN dont la séquence a été analysée, et Reverse, qui se fixent sur le brin complémentaire, ce qui permet une élongation des deux brins, donc la formation d ADN bicaténaire, lors du refroidissement. - De dntp, indispensables à la synthèse des brins d ADN complémentaires et contenus dans le tampon nommé Master Mix. - De MgCl 2 (uniquement pour l amplification du gène codant pour la β-globine), qui augmente la stringence (= diminue le risque de mésappariements) de la réaction. - De polymérase thermosensible pour assurer l élongation. - De tampon adapté à la polymérase pour assurer la stabilité du milieu réactionnel - D eau ultra pure pour ajuster la dilution du milieu. Les séquences d intérêt à amplifier sont : le gène codant pour la β-globine et servant à identifier l ADN cellulaire, et le gène de la luciférase caractéristique de l ADN plasmidique. En retranchant les valeurs de nombre de copies d ADN cellulaire à celles obtenues pour l amplification du plasmide standard comportant le gène codant pour la luciférase, nous pourrons en déduire la quantité de virus attachés aux cellules. En supposant que les temps d élongation entre les deux séquences cellulaires et virales sont similaires, le rapport du nombre de copies d ADN viral sur le nombre de copies d ADN cellulaire nous indiquera l importance de l internalisation moyenne de virus par cellule. Chaque capillaire contiendra un volume de 20µL de milieu de réaction, qui se compose de 2µL d ADN et de 18µL de mix. Il faut toujours prévoir les volumes avec 1 ou 2 capillaires de plus (ici, le mix sera préparé pour 33 capillaires). Vol. total β- globine (µl) Vol. pour un capillaire β- globine (µl) Vol. total plasmide (µl) Vol. pour un capillaire plasmide (µl) H 2 O 198,0 6,0 132,0 4,0 Primer Forward 33,0 1,0 46,2 1,4 Primer Reverse 33,0 1,0 46,2 1,4 MgCl ,6 1,2 Master Mix 330,0 10,0 330,0 10,0 Vol. total 594,0 18,0 594,0 18,0 Tableau 1 : volumes des éléments du mix à pipeter. Procédé : L eau est prélevée en premier car elle permet de diluer les autres composé dans le cône du pipetteur, par pipetage d avant en arrière. Puis les composés du mix sont ajoutés dans 6

7 l ordre du moins cher au plus cher, au cas où un pipetage soit raté et que le mix doive être jeté. Le mix sera bien homogénéisé car le diluant contenant la Taq polymérase (glycérol) ne se mélange pas bien à l eau. 2) Dilutions standard des échantillons dans la glace : L ADN codant pour la β-globine est dilué une première fois à 2,5, puis à 2 et ensuite de 10 en 10. La gamme comporte 5 échantillons. Le plasmide est dilué de 10 en 10, ce qui permettra d établir une gamme étalon de 6 échantillons. Procédé : Il faut utiliser un nouveau cône pour chaque prélèvement. Pour la gamme d ADN, c est le procédé de dilution en cascade qui est adopté : 5µL d ADN pur est prélevé et dilué dans 45µL d eau. Avec un autre cône sont prélevé 5 µl du premier mélange et dilué dans 45µL d eau et ainsi de suite. Attention à ce qu il n y ait pas de liquide sur le cône lors du prélèvement car sinon, la concentration sera plus importante que prévue. 3) Chargement de l ADN dans les capillaires : Dans chaque capillaire sont d abord déposés 18µL de mix. Puis sont déposés les 2µL d ADN, s aider du repère sur le cône pour s assurer que le pipettage est correct et mélanger le prélèvement avec le mix dans le cône. Il faut bien noter le contenu de chaque capillaire sur une feuille. Chaque tube contient soit la gamme étalon, soit le témoin T, soit le plasmide viral 5, 8 ou 35, avec : - des anticorps notés acd 46, - des ARN interférents, notés Si CD 46, - des ARN interférents contrôles, qui ne correspondent à aucune séquence encore connue d ADN de mammifère. Ils n interfèrent donc avec rien, notés Block-it. ( BL signifie que la polarité baso-latérale des cellules est prise en compte). Plasmides : n capillaire contenu n capillaire contenu 1 eau BL acd 46 BL acd 46 BL Témoin F5 Block-it F5 Block-it F5 Si CD BL 1 24 F5 Si CD BL 2 25 F8 Block-it acd 46 BL 1 26 F8 Block-it acd 46 BL 2 27 F8 Si CD BL 1 28 F8 Si CD BL 2 29 F35 Block-it acd 46 BL 1 30 F35 Block-it acd 46 BL 2 31 F35 Si CD BL 1 32 F35 Si CD 46 2 Tableau 2a : Contenu de chaque capillaire de la PCR des plasmides. 7

8 ADN β-globine : n capillaire contenu n capillaire contenu 1 eau 17 F35 acd ADN génomique 2, F35 acd ADN génomique 1, Témoin 4 ADN génomique 1, F5 Block-it 1 5 ADN génomique 1, F5 Block-it 2 6 ADN génomique 1, F5 Si CD F F5 Si CD F F8 Block-it 1 9 F5 acd F8 Block-it 2 10 F5 acd F8 Si CD F F8 Si CD F F35 Block-it 1 13 F8 acd F35 Block-it 2 14 F8 acd F35 Si CD F F35 Si CD F Tableau 2b : Contenu de chaque capillaire de la PCR de l ADN de la β-globine. 4) Précautions à prendre : Pour éviter les risques de contamination des échantillons par de l ADN en suspension dans l air ou des ARNases présentes sur nos mains, la première règle est de porter une blouse et des gants (sans talc car ce produit nuit à la réaction de PCR). La deuxième règle est de bien séparer les zones de préparation du mix (sous la hotte chimique) et des dilutions et chargements de l ADN. Enfin, il faut protéger au maximum les échantillons de l air en rebouchant chaque tube Ependorff et en posant le couvercle du cooling block sur les capillaires. Une fois le mélange de réaction réalisé, fermer le capillaire avec un bouchon stérile. Le capillaire ne doit par être saisi par la partie en verre car si des poussières s y déposent, elles vont dévier le rayon lumineux et fausser la mesure. Toutes ces manipulations sont réalisées dans la glace afin d éviter d initialiser la réaction avant le lancement de la PCR. 5) Programmation de l appareil : Les capillaires sont placés dans le carrousel de l appareil puis délicatement enfoncés. En effet, si un capillaire cassait, il faudrait tout nettoyer à l alcool et vérifier que l appareil ne soit pas contaminé en le faisant tourner avec des blancs (= solutions sans ADN) : s il y a amplification, c est que l appareil est contaminé. Puis les capillaires sont centrifugés quelques secondes et le carrousel est placé dans l appareil à PCR : le Light Cycler. Le programme est ensuite vérifié : 1) une activation est d abord faite à 94 C sur 15 min. 2) une dénaturation à 94 C sur 15 sec est suivie d une hybridation de 5-20 sec puis d une élongation de 10 sec, à 72 C. Dénaturation, hybridation et élongation forment un cycle (durée d environ 45 sec). Ce cycle est répété une 50 aine de fois et la fluorescence émise au début de la phase d élongation, au Curving point ou Cp, est mesurée à chaque cycle. 3) le milieu est rapidement refroidit à 55 C puis progressivement réchauffé (0,1 C/sec) jusqu à 95 C. Ce réchauffement progressif donnera la courbe de fusion qui permet de vérifier que l on n a bien amplifié qu un seul fragment d ADN, celui d intérêt. 8

9 4) Enfin, l appareil est rapidement refroidit à 40 C en 30 sec. Une fois la PCR lancée, on rentre le nom de la gamme et des échantillons correspondants aux numéros des capillaires. Lors du lancement de la PCR, l appareil scanne les tubes et indique le nombre de capillaires qu il a identifié. Si un capillaire est peu rempli, il est alors considéré comme absent. Résultats/discussion : 1) Observation des tubes avant la PCR : ADN plasmidique : Avant de lancer la PCR, on observe les capillaires et on remarque que le capillaire n 15 ne contient pas de mix. De plus, les volumes sont inégaux : les capillaires 12 à 22 sont moins remplis que les autres. ADN β-globine : A l observation des tubes dans le carrousel après centrifugation, tous les tubes semblent remplis également. 2) Quantifications : La courbe obtenue se nomme le profil d amplification. Il présente un bruit de fond, une phase exponentielle et un plateau (dû au manque d un réactif ou au fait que la PCR devienne moins efficace). En tout début de phase exponentielle se situe le Crossing point Cp ou Treshold Cycle C T, qui est le point où s effectue la mesure de la fluorescence. Au niveau du plateau, l intensité de fluorescence est identique pour tous les réactifs (d où l intérêt de se placer dans la phase exponentielle pour mesurer le taux de fluorescence). ADN plasmidique : Lorsqu on observe les courbes de fluorescence du milieu de réaction au Cp (ou CRO, c est-à-dire en début de phase exponentielle) en fonction du nombre de cycles, on peut voir que les courbes de la gamme étalon ne sont pas régulièrement espacées : elles se rapprochent de plus en plus, ce qui signifie que les concentration les plus faibles sont plus importantes que ce qui était attendu. Ceci est probablement dû au fait que, lors des dilutions en cascade, le cône n a pas été changé entre chaque prélèvement. A cela vient s ajouter le fait que le cône présentait peut-être des gouttes à sa surface. La pente de la droite de la concentration logarithmique en fonction du nombre de cycle est de -2,5 alors qu elle devrait normalement se trouver entre -3,32 et -4. Pour information, le rapport entre la pente de la droite et l'efficacité de la PCR est donné par l'équation : Cp (ordonnée y) = (-1/logE) log To (abscisse x) + (log K/logE). Donc la pente de la droite est -1/logE, E étant l efficacité de la PCR (et l ordonnée à l origine est logk/loge). Pour une pente de -3,32 (Efficacité=100%), loge = 0,3 et E=2 soit un doublement de l ADN à chaque cycle de PCR. Pour une pente de -4, loge=0,25 et E=1,78 soit la matrice ADN multipliée par 1,78 à chaque cycle (efficacité = 78%). Pour une pente de -2,5, loge = 0,4 soit E = 2,51 soit la matrice ADN multipliée par un facteur 2,5 à chaque cycle (efficacité supérieure à 100%!). 9

10 Ici, c est la réalisation de la gamme qui est à mettre en cause (dilutions en cascades) ; il faudrait vérifier les pipetteurs de la salle de TP (ils doivent être vérifiés tous les ans). En effet, les concentrations rentrées pour la gamme standard servent au calcul de l efficacité de la PCR, si celles-ci sont erronées, il y aura plus de matrices d ADN que prévu, l efficacité de la réaction sera alors surestimée. Les points de la gamme sortiront donc plus tôt et seront plus proches les uns des autres (tous les 3 cycles environ au lieu des 3,32 si c est une dilution de 10 en 10, car il faut 3 cycles environ pour multiplier les matrices par 8 : premier cycle, *2, deuxième cycle, *4, troisième cycle, *8), augmentant artificiellement l efficacité de la PCR. L intercept est le nombre de cycles au bout duquel une copie est sortie ; normalement, il se situe aux alentours de 40 cycles. Ici, il vaut environ 36, ce qui est très bas : mêmes les petites concentrations en ADN sortent tôt. L erreur est quant à elle très haute puisqu elle est de 34%, suggérant des erreurs de pipettage (qui sont en principe de 10%), mais aussi d autres erreurs. ADN β-globine : Les courbes de fluorescence du milieu de réaction au Cp en fonction du nombre de cycles de la gamme étalon semblent plus correctes. La pente de la droite de la concentration logarithmique en fonction du nombre de cycle est de -1,873, ce qui est encore pire que précédemment. L intercepte vaut environ 31, ce qui est encore plus bas. Par contre, l erreur est bien plus basse puisqu elle vaut maintenant 3,5%. Nos pipetages étaient donc bien meilleurs. 3) Courbes de fusion : Il s agit de la courbe d étalonnage des Cp de la gamme. Elle présente une forme de cloche, car la fluorescence diminue en fonction de l augmentation de la température, puisque le Sybr Green est un intercalant qui ne fluoresce que lorsqu il est fixé entre deux paires de bases. Or le chauffage dissocie les deux brins de l ADN, donc la molécule de Sybr Green se détache et sa fluorescence s arrête. La fluorescence du Sybr Green est donc directement proportionnelle à la quantité d ADN double-brin présente dans le milieu de réaction. Comme on chauffe très vite le milieu de réaction, la fluorescence va s éteindre brusquement. Elle va ensuite réapparaître lentement lors du refroidissement progressif, jusqu à arriver à la température de fusion, où tous les brins d ADN seront doubles. ADN plasmidique : Un pic majeur est observé à Tm (température de fusion) environ = 77,6 C. Cette température est donc la température de fusion de la majorité des produits de la PCR, mis à part pour l eau et les tubes 6 et 7, qui présentent un pic à environ 74,05 C. Il y a donc des dimères d amorce qui sont présents dans le milieu de réaction. Ils se voient notamment dans les milieux contenant peu d ADN, comme les capillaires de la gamme étalon de faible concentration (tube 6 : et tube 7 : ) et l eau, qui a dû être contaminée par le passage de la pipette au-dessus du tube qui la contenait. ADN β-globine : Deux pics très rapprochés se situent environ à 81 et 82 C. Tous les produits ont donc une température de fusion assez proche, ce qui signifie qu ils ne sont pas ou peu contaminés. On n observe plus de dimères d amorce. 10

11 4) Migrations par électrophorèse sur gel d agarose de l ADN plasmidique : Elle permet d authentifier l ADN que l on désirait amplifier, connaissant son poids moléculaire (environ 100 à 200 nucléotides). Elle permet également de vérifier que les ADN n ont pas été contaminés, auquel cas on observerait plusieurs bandes de migration. Méthode : 8 tubes sont sélectionnés : les tubes n 1 (eau), 3 (étalon ), 4 (étalon ), 5 (étalon ), 6 (étalon ), 7 (étalon ), 8 (5 BL 1) et 32 (F35 Si CD 46 2). Les capillaires sont ouverts puis placés côté ouvert vers le fond de tubes Ependorff, dans une centrifugeuse. Une fois l ADN tombé dans le fond du tube Ependorff, du tampon de charge bleu (contenant du bromo-phénol et du bromo-cyanol) est mélangé au milieu. Il va se fixer à l ADN et l entraîner au fond du puit, du fait de sa haute densité. Puis 5µL du mélange sont prélevés et déposés dans un puit du gel. Le premier puis est remplis avec un marqueur de migration ou loading buffer, le marqueur 100 (cf. TP3). Observations : Profil des différents fragments d ADN amplifiés (note : la photo est à l envers). De gauche à droite : échantillons 32, 8, et 7 puis 4 échantillons de la gamme, de concentrations décroissantes, puis témoin (eau) et enfin marqueur 100pb. Tous les échantillons prélevés présente une bande majeure de migration entre 100 et 200 pb, ce qui démontre l unicité des produits PCR. Il s agit donc bien de dimères d amorce. Certains échantillons présentent également une seconde bande de migration (plus faible) en dessous de 100 pb ; il s agit des tubes 5 et 6, qui sont les échantillons de faible concentration en ADN, donc pour lesquels on peut voir apparaître des dimères d amorce. L eau quant à elle présente une bande de migration supérieure aux autres puisqu elle se situe bien en dessous des 100 pb. Dans une PCR, les amorces sont toujours en excès, mais en fonction des amorces (séquence, température de fusion) et des conditions de PCR (température d hybridation, concentration d amorces et de MgCl 2 ), on va ou non favoriser la formation de dimères d amorces, qui correspondent à des amorces s hybridant entre elles : il faut mettre au point une PCR pour faire en sorte de ne plus les observer car ils gênent la quantification (ils augmentent la fluorescence de l échantillon et donc la quantification), mais il est très courant de les observer surtout dans des tubes renfermant peu ou pas de matrice, car dans ce cas, les amorces servent peu à la PCR et ont tout loisir de s hybrider. Ici, nous l avons observé mais dans les tubes renfermant de toutes petites quantités de matrice, donc cela n a pas gêné la quantification de nos échantillons car ils renfermaient tous plus de 200 copies mais si nous avions des échantillons très peu concentrés, il faudrait modifier la PCR pour avoir une quantification précise : diminuer le MgCl 2 ou la concentration d amorces, augmenter la température d hybridation. 11

12 Conclusion : Avantages et inconvénients de cette technique : L avantage du marqueur Sybr Green est qu il est moins toxique que le bromure d éthidium et qu il est légèrement plus sensible qu une sonde. Son inconvénient majeur est son manque de spécificité. Il se fixera sur toute molécule présente dans le milieu de réaction. D où l intérêt de travailler dans les conditions les moins polluantes possibles pour l échantillon. Au niveau de l appareillage, le light cycler ne comporte que 32 puits à capillaire, ce qui limite la quantité d échantillons analysés, surtout que chaque mesure doit être effectuée en double. Les erreurs de pipetage et l hétérogénéité du milieu, notamment en ce qui concerne la mise en suspension de la Taq, sont souvent à l origine de l échec d une PCR. Lors du pipettage, il faut donc faire très attention à ce qu il n y ait pas de gouttes à la surface du cône et à ce que celui-ci prélève bien le bon volume (sur les cônes pour pipetteur de 20µL, une marque est faite à 2 et 5µL, ce qui permet de vérifier l exactitude du prélèvement). De plus, il est utile de bien enfoncer le cône dans le pipetteur avant tout prélèvement, en tapant un peu le cône fixé au pipetteur dans sa boîte avant de l en enlever. La qualité d une PCR réside en la détermination de la séquence de l amorce (ne doivent pas se replier ni se coller entre-elles), la concentration en amorces et la concentration en MgCl 2 (problème d efficacité vs spécificité). Les avantages que présente l appareil sont que la mesure est rapide et qu il couple PCR et analyses. D autre part, les risques de contamination sont minimisés grâce au système des capillaires à usage unique. Par contre, une RT-PCR coûte cher (environ 2 euros par analyse, + le prix d achat des appareils). Retour au contexte de l analyse : Au niveau des mesures de chacun des doubles d un échantillon, le rapport CPR/bruit de fond est très différent d un échantillon à son double ; de plus, l eau et le témoin présentent tous deux une amplification légère, ce qui montrent qu ils ont été contaminés. Les manipulations ne sont donc pas très homogènes. Nombre de plasmides attachés par cellule F5 275 F5 acd F8 390 F8 acd F F35 acd Témoin 0 F5 Block-It 66 F5 Si CD46 73 F8 Block-It 112 F8 SiCD46 55 F35 Block-It 1440 F35 SiCD Tableau 3 : Nombre de plasmides attachés par cellules = rapport quantité d ADN amplifié par la PCR virus/quantité d ADN amplifié par la PCR β-globine, normalisé pour un témoin pur (sans amplification). 12

13 On note une diminution de l activité d amplification de l ADN adénoviral à fibre 5, lorsqu il est en présence d anticorps, alors que l amplification semble peu changer pour les adénovirus à fibre 8 et 35. La protéine CD46 serait donc spécifique au virus à F5, permettant l attachement de ce type de virus. Ce résultat est confirmé par le nombre moyen de virus attaché par cellule (qui diminue de plus de la moitié pour le mélange virus à fibre 5 + anticorps). L anticorps acd46 inhibe donc l attachement des virus à F5 (et pas voie de fait, leur internalisation) et dirigeant les défenses immunitaires contre la protéine fibre CD46, que la fibre 5 semble lier en plus grande quantité que les fibres F8 et F35 (qui ne se lient peut-être pas du tout à cette protéine?). Lors de la comparaison de la quantité d ADN viral amplifié en présence d ARN interférent, et de la quantité d ADN viral amplifié en présence d ARN interférent Block-It (c est-à-dire n interférent avec aucune séquence génomique connue) on observe, pour les adénovirus 8 et 35, qu une plus grande quantité d ADN plasmidique est présente dans les capillaires contenant l ARN Block-It que dans ceux qui contiennent l ARN interférent. En effet, en présence de SiCD46, la quantité d ADN plasmidique amplifié est réduite de plus de la moitié pour l adénovirus à F8, et de plus des trois quarts pour l adénovirus à F35. A l opposé, la présence d ARN interférent dans le milieu de réaction contenant l ADN plasmidique de l adénovirus à F5 ne semble pas altérer la quantité d ADN amplifiée et semble même intensifier un peu cette concentration, comparée à la quantité d ADN amplifiée en présence du Block-It. L ARN block-it est une séquence non présente dans les cellules eucaryotes, il constitue donc le témoin négatif de l introduction d ARN interférents pour CD46. D autre part, l action des ARN interférents est de bloquer le cycle de multiplication du virus par induction du clivage des ARN néosynthétisés. L étude du nombre moyen de plasmides viraux par cellule eucaryote montre que l ARN interférent est actif voir très actif en présence des ADN viraux à F8 et F35. Par contre, il ne joue pas son rôle en présence de l ADN du virus à F5. La protéine CD46 semble donc «protéger» l ADN viral de l ARN interférent, et ceci en induisant la possibilité pour le génome viral, d entrer dans la cellule (où l ARN interférent ne peut pas entrer spontanément, donc ne peut pas avoir d effet sur l ADN viral), par transfection. Dans l hypothèse de cette «protection», il est possible que l adénovirus à F8 soit lui aussi capable de se fixer à CD46, mais en quantité moindre que F5. En effet, le taux d amplification de l ADN de F8 ne diminue que de moitié en présence de SiCD46, alors qu il diminue des trois quarts pour F35. Ainsi, F8 possèderait deux fois moins de fibres lui permettant de se lier à CD46, donc deux fois moins de copies du gène codant pour la protéine fibre qui se lie à CD46 que le virus à F5 ; mais deux fois plus que l adénovirus à F35 (qui n en possède peut-être pas?). D après le nombre d internalisation de plasmides par les cellules, l adénovirus à F8 a tendance à beaucoup mieux se lier aux cellules épithéliales que les adénovirus à F5 et F35. En effet, 390 plasmides à F8 se seraient attachés à une cellule en moyenne, alors que seulement 275 plasmides à F5 et 210 plasmides à F35 s y sont liés. Le virus 8 serait donc plus intéressant pour l étude de l attachement et du transfert des adénovirus. Par contre, CD46 semble être bien mieux liée par les virus à F5 et protége donc mieux leur ADN contre les ARN interférents. L adénovirus à F5 semble donc plus intéressant pour étudier la liaison des virus en présence d ARN interférents. Nous venons d étudier deux méthodes de silencing, l une utilisant les anticorps et l autre, l ARN interférence. Elles sont complémentaires dans l analyse de l attachement des virus puisque la méthode de l anticorps permet de savoir que l adénovirus à F5 se lie préférentiellement au récepteur CD46 et que la seconde permet de savoir que F8 est également capable de se lier à ces récepteurs. 13

14 Bibliographie : Présentation réalisée par Sylvie Lecollinet, ainsi que les polycopiés de cette présentation. Collot S., Alain S. et al., Quantification par PCR en temps réel, technologie TaqMan et applications en virologie. Virologie vol. 5, n 6, pp Hannon J. H., RNA interference. Nature publishing group. Agrawal N., Dasaradhi P. V. N. et al., 2003.RNA interference : biology, mechanism, and applications. Microbiology and molecular biology reviews, vol. 67, No. 4, pp Haywood A. M., Virus receptors : binding, adhesion strengthening, and changes in viral structure. Journal of virology, vol. 68, No. 1, pp TP2 : Mise en évidence du rôle des protéines chaperonnes par transfection cellulaire Principe de la technique : Le but d une transfection est d étudier l acquisition d une nouvelle compétence dans un contexte donné, par exemple, l acquisition d une résistance sur le fait de pousser dans un milieu de culture particulier. La transfection consiste à introduire une nouvelle séquence génique (souvent codant pour une protéine rapporteuse, c est-à-dire induisant un phénotype observable) dans la cellule (voir dans le génome de la cellule), par transport d un plasmide d origine viral au travers de la bicouche lipidique. Le plasmide est dit recombinant car la séquence génique d intérêt y a été incérée, souvent devant un promoteur eucaryote car ce sont des cellules eucaryotes qui sont transfectées. Si la séquence génique se intègre le génome de la cellule transfectée (via les transposons), la transfection est réalisée à long terme. Si le plasmide reste tel quel dans la cellule, il passera dans l une des deux cellules formés au cours de la mitose et sera perdu pour l autre cellule : c est une transfection transitoire. Dans le contexte de ce TP, la transfection est réalisée sur des cellules de mammifère, ce qui implique que la cellule soit en période de division pour pouvoir intégrer le plasmide. Contexte expérimental : De plus en plus de stress sont induits sur les plantes et les animaux, à cause du réchauffement de la planète, qui induit sécheresses et augmentation de la salinité. Les cellules, qu elles soient d origines animales ou végétales ont donc développés des mécanismes protecteurs. 14

15 Lors d un un stress (élévation de la température, de la salinité ou du ph), un mécanisme protecteur s active au sein des cellules. Il s agit de la surexpression de protéines du choc thermique (Hit Shock Protein ou HSP), qui contribuent à une meilleure tolérance des cellules lors de leur soumission au stress pour la seconde fois (elles deviennent thermorésistantes, etc ). La protéine HSP 70 est la protéine majoritairement impliquée lors d un choc chez les cellules de mammifères. Aussi appelée protéine chaperonne, elle se fixe au ribosome, en temps normal, et aide au repliement correct de la protéine néosynthétisée. En cas de stress, elle est surexprimée et se lie à des protéines dénaturées, en particulier sur des domaines hydrophobes exposés. Elle protège ainsi contre les interactions spécifiques et permet d éviter la formation d agrégats. Le principe de cette étude est de vérifier si l expression d HSP 70 dans une cellule de mammifère protège les protéines de la dénaturation, lors d un choc thermique. La protéine reporter utilisée sera la luciférase, enzyme du vers luisant Photinus pyralis, non exprimée chez les mammifères. Le gène codant pour cette protéine sera incéré dans un plasmide viral avec lequel des cellules fibrocytaires de hamster (lignée O23) seront transfectées. Un des deux échantillons de cellules sera également transfecté par un plasmide recombinant dans lequel sera incérée la séquence génique codant pour la HSP 70, afin que celle-ci soit surexprimée dans la cellule, surtout au moment du choc, afin d observer son effet protecteur sur la protéine luciférase. Les échantillons cellulaires seront ensuite chauffés dans un bain marie de 42 C pendant des durées croissantes et le taux d émission des photons (= taux d inactivation de la luciférase) sera ensuite mesuré. Matériel et méthodes : Les cellules O 23 sont des fibroblastes de hamster, qui ont été congelées à l azote liquide (souche immortelle). De forme allongée, ces cellules ont déjà été citées dans la littérature. Leur avantage est qu elles réalisent deux mitoses par jour donc ont une croissance très rapide. La luciférase catalyse une réaction utilisant la luciférine comme substrat et résultant en une émission photonique, qui peut être mesurée par un luminomètre : ATP > PPi O 2 Luciférine > Luciféryl-AMP > Oxyluciférase + AMP hν Cette protéine est souvent utilisée comme modèle dans les études de dénaturation/inactivation protéique, car elle est très sensible à l élévation de la température et son activité enzymatique décroît alors rapidement. Le plasmide viral recombiné est composé d un promoteur eucaryote (nommé psp64 et inductible par le choc thermique) ; puis d une séquence d ADN codant soit pour la luciférase, soit pour la HSP 70. 1) Précautions à prendre : Les manipulations sont réalisées dans le bâtiment de microbiologie. Comme il s agit de cellules animales, il faut travailler dans les conditions les plus stériles possibles. Il faut donc : - porter une blouse et des gants stériles, - travailler sous hotte de culture, - nettoyer la paillasse au désinfectant anti-bactérien, 15

16 - placer les objets contaminés loin du plan de manipulation, - saisir les objets par le côté et ne pas toucher les bords, - ne jamais passer la mais ou des objets au-dessus de la préparation, - toujours refermer la préparation quand c est possible et poser les couvercles sur le dos, - Ne sortir les préparations de la hotte que si elles sont hermétiquement protégées. 2) Transfection par la méthode du précipité de phosphate de calcium : Le phosphate de calcium va servir de vecteur à l insertion du plasmide (comportant le gène de la luciférase ou celui de HSP 70). En effet, ce précipité va se fixer à l ADN plasmidique, formant une petite boule, et la cellule en stade de division va absorber cette boule. Les gènes contenus dans les plasmides vont alors s exprimer, de façon transitoire, dans le cellule. Protocole : Les cellules ont d abord été placées au bain marie à 37 C. Le précipité est préparé en mélangeant 10µg de plasmide (condition 1 : 1µg de plasmide luciférase + 9µg de psp60 ; condition 2 : 1µg de plasmide luciférase + 1µg de plasmide HSP µg de psp60) avec 250µg de tampon HBS 2x. Le mélange est mis au bain marie à 25 C pendant au moins 10 min. 250µL de CaCl 2 sont ensuite ajoutés dans chaque tube, durant une minute, pendant que le tube est vortexé. Tout ceci permet d obtenir le précipité. Les deux tubes sont alors replacés 20 min au bain marie à 25 C. Pendant ce temps, les cellules en cultures sont sorties du bain à 37 C et le milieu nutritif (DMEM/FCS, composé de sérum + indicateur de ph : rouge pour neutre, magenta pour basique et jaune pour acide) est retiré des cellules. Ces dernières sont alors lavées, avec le même tampon que celui qui a servit à faire le précipité : HBS 2x (20mL). Une fois le tampon déposé dans la coupelle, bien homomgénéiser le tout puis aspirer le tampon. Ajouter le précipité d ADN goutte-à-goutte et attendre 20 min à température ambiante. Enfin, ajouter 20mL de DMEM/FCS et laisser à l étuve (37 C + CO 2 ) pendant la nuit. 3) Repiquage des cellules : Les cellules sont attachées au fond de la boite et l enzyme trypsine ne permet lé détachement en se fixant sur les glycoprotéines. La présence du sérum inactive donc cette enzyme. Après aspiration du milieu, les cellules sont donc lavées avec du PBS, afin d éliminer toute trace de sérum, qui colle à tout. 1 ml de trypsine est ajouté après aspiration du tampon et agit durant 4 min. Les cellules sont alors suspendues dans le milieu, par des aspirations du milieu à la pipette et rejet de celui-ci sous forme de jet sur les cellules restées collées à la paroi de la boîte de pétri et qui forment une pellicule blanche. Les cellules sont alors prélevées et placées dans un tube, contenant 20mL de milieu DMEM/FCS, ce qui a pour effet d arrêter l activité enzymatique. Puis les deux milieux sont répartis dans 13 tubes chacun (500µL/tube) puis placés à l étuve pour la nuit. 4) Choc thermique : La température et la durée du choc thermique déterminent le niveau de dénaturation donc d inactivation de la luciférase. Les tubes contenant les cellules transfectées sont plongées dans un bain marie de 37 C. (Chaque temps donné exprime le temps de moment où les tubes du groupe 1 sont 16

17 transférés ; les tubes du groupe 2 sont transférés 30 sec après). A T0, 4 tubes de chaque milieu sont placés dans la glace et tous les autres tubes sont transférés dans un bain marie de 42 C. A T2 min, 2 tubes de chaque milieu sont placés dans la glace, même chose à T 5, T10 et T15 où le tube restant de chaque groupe est placé à la récupération, dans le bain marie de 37 C. 5) Lyse des cellules : Les cellules sont lavées car le milieu inhibe la réaction enzymatique de la luciférase. Puis 500 µl de PBS froid est ajouté au milieu. La technique de pipetage alors utilisée est celle du pipetage inverse : le piston du pipetteur est poussé à son deuxième cran ; le cône est plongé dans le tampon, puis le piston est remonté jusqu en haut. Le dépôt dans le tube se fait en poussant le piston du pipetteur jusqu au premier cran seulement. Le cône est alors replongé dans le tube de prélèvement et le piston est remonté, ainsi de suite. Cette technique permet une meilleure précision lors du pipetage car tout le volume est éjecté et il ne risque pas de rester une bulle ou un peu de liquide résiduel sur la paroi du cône. Cette technique est donc employée lors de plusieurs prélèvements du même volume du même liquide, surtout lorsqu il s agit de petits volumes. Le tampon est ensuite aspiré puis 500 µl de tampon de lyse, contenant du β-mercaptoéthanol (protecteur de l oxydation spontanée de la luciférase, très odorant) est ajouté. Dès l ajout de celui-ci, l activité enzymatique de la luciférine commence, produisant la luciférase et l émission d un photon. 6) Détection de l inactivation de la luciférase : Des prélèvements de 5 et 20 µl de chaque échantillon sont déposés dans des puits à luminomètre, dont la configuration est notée sur papier. 4 témoins, ne contenant que du tampon de lyse, sont réalisés entre chaque série. Résultats : Groupe témoin (20 microlitres) Taux de fluorescence de la luciférase Tampon 0,001 0,0004 0,0007 0,0008 Pas de choc 0,4127 0,428 0,337 0,3613 choc 2 min 0,3398 0,3258 choc 5 min 0,0706 0,075 choc 10 min 0,0329 0,0337 choc 15 min 0,0261 Récupération 0,0439 Groupe HBR70 (20 microlitres) Taux de fluorescence de la luciférase Tampon 0,002 0,0004 0,0005 0,001 Pas de choc 0,0356 0,0294 0,0298 0,0345 choc 2 min 0,0217 0,0173 choc 5 min 0,015 0,0157 choc 10 min 0,0118 0,0147 choc 15 min 0,01 0,0092 Récupération 0,

18 Groupe témoin (50 microlitres) Taux de fluorescence de la luciférase Tampon 0,0006 0,0004 7,96 E-5 0,0007 Pas de choc 0,4138 0,4569 0,4629 0,3969 choc 2 min 0,3166 0,3454 choc 5 min 0,0777 0,0673 choc 10 min 0,0326 0,0326 choc 15 min 0,03 0,0257 Récupération 0,0697 Groupe HBR70 (50 microlitres) Taux de fluorescence de la luciférase Tampon 0,0004 0,0007 0,0008 0,0004 Pas de choc 0,0356 0,0288 0,0354 0,0341 choc 2 min 0,0215 0,217 choc 5 min 0,0169 0,0154 choc 10 min 0,0118 0,0137 choc 15 min 0,0095 0,0146 Récupération 0,0345 Tableau 3 : Pourcentages d émission photonique pour chaque puis, mesuré au luminomètre. Luciferase inactivation + recovery in presence of HSP70 16/09/ Relative luciferase activity (%) control 20ul control 50ul HSP70 20ul HSP70 50ul time (min) HS at 42C (1-15 min) and recovery at 37C (15-45 min) Fig. 1 : Graphique de l activité relative de la luciférase en fonction du temps de choc à 42 C (avec une récupération entre 15 et 45 min.). La valeur de 100% a été attribuée à la mesure de l émission photonique pour les échantillons n ayant pas été stressés et une échelle linéaire a été appliquée en abscisses. Source : A. Michels. Discussion : L avantage de cette protéine rapporteur (la luciférase) est que comme aucune enzyme de la cellule de mammifère n émet de lumière, le bruit de fond de la réaction de la catalyse par la luciférase est pratiquement absent et l on n en tiendra pas compte dans cette analyse. 18

19 Une large différence entre les deux groupes est facilement remarquable. En effet, l inactivation de la luciférase chute bien plus brutalement pour le milieu contrôle que pour le milieu transfecté avec les plasmides de luciférase et de HSP 70. L hypothèse est donc que la protéine chaperon protège la luciférase de son agrégation ou de sa dénaturation suite au choc thermique, en se fixant sur ses sites hydrophobes mis à nus et en lui permettant de se replier correctement, donc de reprendre une activité catalytique qui induit l émission de photons. Ainsi, le taux d émission de photons reste plus haut pour le milieu de cellules transfectées par les deux plasmides. Une autre hypothèse consisterait à prendre en compte la compétition pour l expression des gènes contenus dans les deux plasmides. En effet, si la cellule n est pas capable de synthétiser ces deux types de protéines en grand nombre, comme le gène codant pour la HSP70 est dirigé par un promoteur fort, sa transcription sera favorisée au détriment de celle du gène codant pour la luciférase. Ainsi, il y aura trop de protéines HSP pour la quantité de luciférase, ce qui causera un déséquilibre dans le système, notamment au niveau du repliement de la luciférase. De plus, peu de différences intergroupe d émissions photoniques sont observées, entre les courbes de 20 µl et de 50µL de prélèvement. Cela suggère que la luciférine serait le substrat limitant de la réaction, ce qui normalement ne devrait pas être le cas. Il est à noter que la récupération après 15 min de choc est 30 min de bain marie à 37 C, dans le groupe des cellules transfectées par les deux plasmides entraîne un taux d émission photonique supérieur au taux des cellules non choquées. Ceci montre que même après un choc très dure, certaines cellules arrivent à survivre. Une interprétation de ce phénomène serait que le choc n a détruit qu une partie de la machinerie cellulaire et que les 30 minutes de récupération ont suffit à ce que les protéines qui ont été protégées par la HSP 70 se replient. Puis l activité enzymatique repart de plus belle. Une autre hypothèse serait que comme le promoteur psp64 est inductible par le choc thermique, il induirait la néosynthèse de HSP 70 et de luciférase, phénomène qui s ajouterait à la récupération normale de la luciférase dénaturée et amplifierait le processus. Afin de s assurer de ne mesurer que le taux de récupération de la protéine, il faudrait faire une expérience parallèle où on stopperait la néosynthèse de protéines par le cycloheximide, composé qui inhibe la traduction des protéines. Néanmoins, il faut également tenir compte de la demie-vie de chaque protéine et essayer de découpler tout ces phénomènes, ce qui n est pas chose aisée et ne permet pas, à l heure actuelle, de formuler une seule réponse. Conclusion : Ce genre d études permet également d étudier les conséquences d un choc thermique suivant une exposition au laser de cellules tumorales. En effet, le choc thermique permet de détruire les protéines à l origine de la réparation de l ADN ; mais il induit également la synthèse des protéines HSP qui font que la cellule va devenir thermorésistante. Des études sur les protéines HSC (équivalent de HSP des mammifères) chez A. thalliana et sur le riz basmati montrent que la surexpression de ces gènes dans la plante présente un avantage de résistance au choc thermique ; mais le revers de la médaille est que la croissance des plantes est moindre, aussi bien au niveau de la tige et des feuilles qu au niveau des racines. Cet aspect est peut-être dû au coût biologique qu entraîne la transcription puis traduction de ces gènes supplémentaires. Une autre hypothèse serait que la présence de ce trop 19