PURIFICATION DES PROTEINES FPB - L3 BCP

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1 PURIFICATION DES PROTEINES FPB - L3 BCP Année Daniela LENER IBMC

2 Purification des protéines Pour pouvoir étudier ou utiliser une protéine il faut la purifier : séparation de la protéine d intérêt d un mélange complexe d acides nucléiques, lipides, carbohydrats, autres protéines, métabolites. Les prérequis de pureté dépendent de l utilisation de la protéine d'intérêt : antigène pour la production d anticorps ou séquençage N-ter < 95% études des propriétés physicochimiques, cristallographie 95-99% utilisation thérapeutique, études in vivo > 99% PURE, HOMOGENE Protocoles de purification RENDEMENT MAXIMALE FONCTIONNELLE (max activité catalytique)

3 Purification des protéines La purification d une protéine consiste de trois phase principales: 1) Le choix de la source 2) La méthode d extraction 3) Les méthodes de séparation

4 Choix d une source de protéines Protéine spécifique d un tissu d un organisme bien précis tissu de cet organisme Protéine du métabolisme fondamentale de tout organisme source plus avantageuse

5 Choix d une source de protéines Protéine spécifique d un tissu d un organisme bien précis tissu de cet organisme Protéine du métabolisme fondamentale de tout organisme source plus avantageuse Clonage moléculaire gène protéine d intérêt surexpression dans un organisme approprié (protéine sécrétée, periplasmique ou intracellulaire) Bactérie Levure Insecte Mammifère in vitro Facilité du procédé /- complexe, lent /- compl, lent compl, lent compl, lent simple, rapide Expression rapide rapide assez lente assez lente très rapide Production élevée élevée moyenne moyenne faible milieu pas cher pas cher coûteux coûteux coûteux protéine sécrétée? souvent, avec aussi souvent parfois rarement ne s'applique pas corps d'inclusion purification simple simple assez simple assez simple simple co-expression difficile difficile assez facile difficile facile Interférence avec l'hôte rarement rarement rarement rarement non Repliement correct pas toujours pas toujours oui oui pas toujours N-glycosylation non oui, riche en mannose simple, pas d'acide complexe non sialique O-glycosylation non oui oui oui non phosphorylation sur Tyr; très rare sur oui oui oui non Ser et Thr acétylation non oui oui oui non acylation du N-term non oui oui oui non gamma- carboxylation non non non oui non

6 Choix d une source de protéines Clonage moléculaire gène dans vecteurs pour protéine de fusion surexpression de la protéine d'intérêt recombinante dans un organisme approprié. La présence d un «tag» de caractéristiques connues peut simplifier l expression (et le rendement)) l isolation, la purification et la détection de la protéine d'intérêt recombinante. Protéine Glutathion S-transférase (GST) Etiquette 6 histidines (His 6 ) Le site de clivage pour une protéase spécifique entre tag et prot. d'intérêt permet la purification de la protéine sans étiquette.

7 Techniques de solubilisation Pour purifier une protéine il faut l extraire de son milieu naturel (cellule) dans une solution tampon pour garder le ph du lysat entre 7-8, ph proche du ph physiologique. Plusieurs choix sont possibles selon la nature de la source: tissu mixeur et/ou collagénase C d insecte ou de mammifère Choc osmotique (tp hypotonique) tp physiologique détergents (NP-40, triton X-100) Lyse mécanique: homogénéisateur Dounce ou Potter

8 Techniques de solubilisation Bactéries tp physiologique Lysozyme (dégrade la parois bactérienne); sonication (ultrasons); presse de French (passage à haute pression par un petit orifice); billes de verre. Levures tp physiologique zymolyase ou lyticase (dégradent la parois des levure); billes de verre; presse de French.

9 Stabilisation des protéines La chaleur dénature les protéines ainsi que le contact avec l air (oxygène---> oxydation) il faut donc toujours travailler entre 0-4 C en évitant de faire mousser le lysat. Il faut aussi ajouter au lysat: agents réducteurs des ponts disulfures: -mercaptoethanol (CH 2 OH-CH 2 SH), dithiotreitol Cys---S---S---Cys 2 CH 2 OH-CH 2 SH <----> 2 Cys---SH CH 2 OH-CH 2 S---SCH 2 -CH 2 OH agents chélateurs de cations: EDTA (éthylène diamine tetra-acetate; Mg 2, Mn 2, Zn 2 ),, EGTA (éthylène glycol tetra-acetate; Ca 2 ). Inhibition des metalloprotéases. inhibiteurs de protéases: PMSF (serines protéases dont acétylcholine estérase!), Pepstatine A (protéases aspartiques), aprotinin, leupeptin et chymostatin (serine protéases à spectre /- ample). agents stabilisateurs: glycérol (stabilise les interaction protéine-protéine).

10 Clarification du lysat Pour éliminer les débris cellulaires le lysat peut être centrifugé, laissant dans le surnageant la protéine recherché. Centrifugation différentielle:

11 Méthodes de séparation et de purification Elle exploitent les propriétés qui différentient les molécules. Méthodes douces non dénaturantes qui préservent l intégrité des molécules. Méthodes conventionnelles: exploitent les propriétés physicochimiques générales des molécules taille et encombrement : charge : chromatographie par filtration sur gel ou tamisage moléculaire électrophorèse sur gel de polyacrylamide chromatographie par échange d ions (groupes chargés en surface) électrophorèse sur gel de polyacrylamide, isofocalisation (séparation en fonction de leur phi) hydrophylicité et hydrophobicité: relarguage par les sels chromatographie sur support hydrophobe masse et densité : centrifugation Méthodes spécifiques: exploitent les propriété particulières des macromolécules biologiques chromatographie d affinité: rétention spécifique de la protéine par son ligand immobilisé sur un support.

12 Effet des sels sur la solubilité des protéines La solubilité d une protéine en solution aqueuse est fonction de la concentration en sels dissous. La concentration en sels est exprimé par la force ionique I: I=1/2 c i Z 2 i c i = concentration molaire des espèces ioniques Z i = charge ionique La solubilité d une protéine à faible force ionique augmente avec la concentration en sels: Salting in Protéines agrégées par les interactions ioniques; Contre-ions entourent les charges des protéines, augmentant leur solubilité Agrégats peu solubles NaCl Solubilisation (meilleur solvatation) Pour des forces ioniques élevées, la solubilité des protéines diminue: Salting out L eau est insuffisante pour hydrater aussi les protéines, qui sortent donc de solution et précipitent. - - >>(NH 4 ) 2 SO 4 Déstabilisation de l eau d hydratation organisé - - Agrégats Protéines s agrégent par interactions hydrophobes.

13 Effet des sels sur la solubilité des protéines Courbe de solubilité en fonction de la force ionique Solubilité Optimale Salting in Salting out (NH 4 ) 2 SO 4 1 Force ionique 2 La série de Hofmeister ci-dessous décrit les effets relatifs de différents ions sur la précipitation des protéines ou la promotion de leurs interactions hydrophobiques. précipitation PO 4 3- > SO 4 2- > COO - > Cl - > Br - > NO 3 - > ClO 4 - chaotropique (salting out) NH 4 > Rb > K > Na > Cs > Li > Mg 2 > Ca 2 (salting in)

14 Séparation des protéines par salting out (relarguage) Domaine hydrophobe La solubilité d une protéine en solution aqueuse est fonction de la concentration en sels dissous. Solubilité La solubilité de différentes protéines à même force ionique dépend de l hydrophobicité de chaque protéine. Accroissement de la force ionique détermine un ordre de précipitation Solubilité NaCl Force ionique Le salting out est à la base de la précipitation fractionné des protéines. Etape grossière de purification qui peut éliminer jusqu à 50-70% des contaminants. Le sulfate d ammonium, (NH 4 ) 2 SO 4, est le sels le plus utilisé. Première étape Purifier et concentrer l échantillon Pas dénaturante (NH 4 ) 2 SO 4 Force ionique En effet, les ions qui diminuent la solubilité des protéines stabilisent leur structures natives.

15 Dialyse La dialyse permet de séparer les molécules selon leur taille, en utilisant des membranes semi-perméables dont les pores ont une taille bien définie, inférieure aux poids moléculaire des macromolécules que on veut garder. Ce poids est le poids moléculaire d exclusion (molecular weight cut off - MWCO). Cette technique est utilisée pour: dessaler un échantillon, changer le tampon de l'échantillon ou pour concentrer une solution macromoléculaire (polyethylène glycol) Dialyse O.N. 4 C

16 Chromatographie sur colonne La séparation des protéines par chromatographie sur colonne se base sur l équilibre de répartition des molécules entre une phase mobile (le solvant contenant les protéines) et une phase stationnaire (matrice solide). La phase stationnaire ou matrice est constitué de billes de différent diamètre: billes de silice O 4-40 μm bar (HPLC) Condition dénaturantes billes de silice O μm 1-10 bar (FPLC) agarose, cellulose, acrylamide billes O μm pression atmosphérique condition non dénaturantes La matrice peut avoir des groupes fonctionnels différents: groupes chargés, molécules hydrophobiques (C4-C18), ligands spécifiques. La phase mobile dépend de la technique de séparation.

17 Chromatographie sur colonne La séparation des protéines par chromatographie sur colonne suit deux grands principes: 1. Adsorption des molécules sur la phase stationnaire. La protéine passe de la phase mobile à la phase stationnaire (la protéine est adsorbé) et elle séparée sur la base de son interaction avec le support. Chromatographie par échange d ions, chromatographie sur support hydrophobe, chromatographie d affinité. 2. La phase stationnaire fonctionne comme un tamis et les protéines sont séparées en fonction de leur taille et de leur forme. La protéine reste toujours en solution. Chromatographie par filtration sur gel (ou par exclusion ou tamisage moléculaire). Le pouvoir de résolution de la chromatographie vient de ce que le processus de séparation se déroule de manière continue tout au long de la colonne.

18 Schéma de l appareillage de chromatographie

19 Chromatographie par adsorption

20 Chromatographie par échange d ions Cette méthode de séparation utilise les interactions électrostatiques que se établissent entre les protéines et le support chromatographique. Le support ---> de synthèse (polystyrène) densité de charge élevé ---> rétention élevé grandes variation de ph dénaturantes interactions aspécifiques aa, peptides, oligonucléotides, désionisation de l eau Naturel (Cellulose, dextrane, agarose) faible densité de charge ---> faible rétention ne supportent pas grandes variation de ph non dénaturantes pas d interactions aspécifiques protéines Les groupes chargés ---> positivement échangent des anions négativement échangent des cations

21 Résines échangeurs de Anions Cations Echangeur faible ---> base faible, à ph basique perd la charge. 2 <ph < 10 Echangeur faible ---> acide faible, à ph<4,5 perd la charge (acquière H ). Echangeur fort ---> base forte, la charge est maintenue pour des ph entre 2 et 14. Echangeur fort ---> acide fort, à ph<2 perd la charge (acquière H).

22 Chromatographie par échange d ions Dans le processus d échange d ions, les ions liés électrostatiquement à la matrice chargé (positivement ou négativement) sont remplacés de manière réversible par des ions en solutions (protéines chargées). Cette phase est l adsorption. Les matrices échangeurs d anions d fixent les protéines chargées négativement. Les matrices échangeurs de cations fixent les protéines chargées positivement. Pendant la phase d adsorption les diverses protéines se lieront à la matrice avec affinité électrostatique différente qui dépend de la charge, de la densité de charge et la distribution de charge. L élution ou désorption sélective se fait en variant la force ionique ou le ph du tampon d élution (pour changer la charge de la protéine). La chromatographie par échange d ions lier la protéine d'intérêt et laisser passer les contaminants ou l inverse. 1ère méthode est la plus efficace degré élève de fractionnement, échantillon concentré.

23 Chromatographie par échange d ions Enchaînement d aa liés par des liaisons peptidiques. Le pka des groupes ionisables des protéines varie de 4 à 12 (ex. pka Asp= 4, pka Lys=10,5) La charge nette d une protéine dépend du ph: Caractère amphotère ph isoélectrique = ph auquel la charge nette est zéro ph>phi charge nette négative, liaison ech. anionique ph<phi charge nette positive, liaison ech. cationique Les ph extrêmes dénaturent les protéines donc il faut tenir compte de la stabilité de la protéine pour choisir le ph de travail et donc le type d'échangeur à utiliser. Distribution de charge (existence de domaines chargés). Charge - phi Nombre de charge : peu chargées---> faiblement retenues---> élution à faible concentration de sels très chargées---> fortement retenues---> élution à forte concentration de sels

24 Echangeur d anions CH 2 -CH 3 DEAE (diéthylaminoéthyl) cellulose -O-CH 2 -CH 2 - NH Cl - CH 2 -CH 3 Cl - Na Cl - Cl - Cl - Cl - _ >>Na Cl - Cl - Cl- Cl - _ Na DO 280nm _ Na Na Na Na Na _ Na Na Na Na Na 1M NaCl Na Na _ Na Na Na Fractions (ml)

25 DO Séparation des protéines des acides nucléiques sur échangeur anionique DO 260nm DO 280nm 2M NaCl 1M Protéines basiques non retenues Protéines privées d acides nucléiques A 280nm A 260nm = 1,8 Fractions (ml)

26 DO Echangeur de cations CM (carboxyméthyl) cellulose -CH 2 -COO - Na P (phospho) cellulose -PO 3 Elution avec un gradient linéaire de concentration croissante de NaCl DO 260nm DO 280nm Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - Cl - 1M NaCl Acides nucléiques et protéines acides non retenus Fractions (ml)

27 Chromatographie par interaction hydrophobe L hydrophobicité est la capacité des zones non polaires d une ou de plusieurs molécules à s associer entre elles pour minimiser l exposition de la zone hydrophobe au solvant polaire. Les résines portant des groupements hydrophobiques (cycliques ou aliphatiques) permettent de séparer les protéines en fonction de leur hydrophobicité. Une colonne de chromatographie par interaction hydrophobe est chargée à haute force ionique et éluée avec un gradient décroissant de sels. Domaine hydrophobe chaîne C DO 280nm Elution gradient decroissant NaCl Augmentation de l hydrophilicité des protéines ---> élution ml

28 Chromatographie d affinité La chromatographie d affinité est idéale comme technique de capture de la protéine d'intérêt ou comme étape intermédiaire d un protocole de purification. La possibilité d effectuer ce type de technique dépend de la disponibilité d un ligand biospécifique lié ou à lier de façon covalente à une matrice chromatographique. La chromatographie d affinité se base sur le principe de l adsorption spécifique: l interaction réversible entre une protéine bien déterminée (ou un groupe de protéines) et son ligand spécifique fixé sur une matrice chromatographique. Avantages: sélectivité élevée, résolution élevée, grande capacité de liaison de la protéine d'intérêt. enrichissement de l ordre de milliers de fois! Interaction réversible Elution interactions électrostatiques et/ou hydrophobes forces de Van der Waals liaisons hydrogènes. spécifique : compétition avec un excès de ligand compétitif non spécifique : changement de ph, force ionique ou polarité

29 Chromatographie d affinité Préparation de l échantillon et adsorption à la matrice: Elution : - Echantillon clarifié (centrifugation, filtration) - Echantillon dans le tampon de liaison (binding buffer) - Tester l interaction ligand / protéine : trop faible ou trop forte ---> faible rendement - Tester la vitesse de flux de la phase mobile (échantillon) pendant l adsorption interactions à haute affinité = vitesse de flux élève interactions à basse affinité = vitesse de flux lente - Volume d échantillon non limitant - Début de l élution quand le lavage donne une DO 280nm basse - par compétition soit avec le ligand soit avec la protéine d'intérêt - par changement de ph ---> changement de ionisation élution par baisse de ph ---> fraction récoltées dans tampon de neutralisation - par augmentation de la force ionique ---> élution douce effectuée avec gradient de NaCl - par utilisation d agents chaotropiques Pour obtenir des pics nets il faut utiliser une vitesse de flux la plus basse possible.

30 Chromatographie d affinité La chromatographie d affinité se base sur le principe de l adsorption spécifique: interaction entre une protéine bien déterminée à purifier et son ligand spécifique fixé sur une matrice chromatographique. Adsorbants à spectre large: spécifiques d une classe de protéines. Adsorbants spécifiques: matrice sur laquelle on fixe de manière covalente le ligand spécifique de la protéine à purifier substrat spécifique (élution avec excès de substrat ou analogue structural) anticorps spécifiques (dénaturation ph 3 ou ph 12) protéine de fusion

31 Chromatographie d affinité Résine Affinité pour... Calmoduline sepharose 4B ATPases 5' AMP sepharose 4B kinases dépendantes de l'atp DNA-agarose ADN polymérases, protéines liant l'adn Colonnes d'héparine Lipases, protéines liant l'adn Poly(U) sepharose Transcriptase réverse, ARNm Arginine sepharose 4B Sérine protéases Lysine sepharose 4B ARNr Cibacron blue F3G-A enzymes nécéssitant des nucléotides ConA Sepharose 4B glycoprotéines / -D-mannose, -D-glucose et des sucres similaires Wheat germ Lectin Sepharose glycoprotéines contenant du N-acetyl- -D-glucosmine Résine CNBr-activated Sepharose 4B EAH Sepharose 4B Activated thiol sepharose 4B rprotein A sepharose Groupe à coupler -NH2 -COOH -SH Partie Fab des anticorps

32 Chromatographie d affinité : tag GST La glutathion S-transférase est une des étiquettes les plus utilisée pour faciliter la purification et la détection de protéines recombinantes. Le glutathion est lié de façon covalente à des billes de sepharose. Sa structure est complémentaire au site actif de l enzymes GST. Avantages: Utilisation dans n import quel système d expression La procédure de purification donne un rendement élevé de protéine pure Site de coupure pour une protéase spécifique entre tag et prot. d'intérêt Purification simple. Conditions douces d élution minimisent les dégâts pour la prot. d'intérêt La GST peut stabiliser la structure de la protéine recombinante GST est facilement détectée par les anticorps (Western blot) Large gamme de résines disponibles pour la purification La cinétique de liaison entre la GST et le glutathion est lente donc il faut utiliser une vitesse de flux assez lente. Le volume d échantillon n est pas limitant. L élution est le plus souvent effectuée par compétition avec du glutathion libre. Si pb d élution ---> la concentration de glutathion, du ph jusqu à 9, de la vitesse de flux.

33 Chromatographie par filtration sur gel

34 Chromatographie par filtration sur gel La chromatographie par exclusion ou tamisage moléculaire est une technique qui permet de séparer les molécules en fonction de leur taille et de leur forme (encombrement). Matrice = granules de gel poreux; le diamètre des pores est contrôlé et fluctue autour d une valeur moyenne qui est caractéristique de chaque type de gel. Dépôt d un mélange de molécules: 1. molécules de taille > O des pores se déplacent dans la phase extra-granulaire (exclues = 1éres éluées) 2. molécules de taille < O des pores rentrent dans la phase intrgranulaire (incluses = dernières éluées) 3. molécules de taille comprise dans les limites du O des pores sont partiellement incluses (éluées dans l ordre de taille décroissante)

35 Chromatographie par filtration sur gel Nom de la résine Capacité de fractionnement (en Da) type dextran Sephadex G Sephadex G Sephadex G Sephadex G type polyacrylamide Bio-gel P Bio-gel P Bio-gel P Bio-gel P type agarose Sepharose 2B Sepharose 4B Bio-gel A-0,5M Bio-gel A-15M Bio-gel A-150M Pour une bonne séparation il faut une haute concentration et un faible volume de matériel de départ. La forme d'une colonne de filtration devrait être étroite et longue pour une meilleure séparation. La filtration sur gel se fait avec un tampon dont la nature ne change pas pendant la séparation. Ceci permet de garder les complexes macromoléculaires.

36 Chromatographie par filtration sur gel Pour chaque colonne de gel filtration on peut définir les volumes suivants: V T = volumes totale V 0 = volume vide (volume de solvant entre les billes, déterminé avec le bleu dextrane) V x = V T -V 0 = volume de la matrice (gel solvant) V e = volume d élution protéine V i = V T -V 0 -V gel = volume du solvant dans les pores de la matrice disponible à la diffusion des petites molécules Coefficient di distribution (Kd( Kd) entre la phase mobile et la phase stationnaire est spécifique de chaque molécule et de chaque colonne. Kd représente la fraction de la phase stationnaire disponible à la diffusion d une déterminé molécule. Kd = (V e V 0 ) / (V T -V 0 -V gel ) Cependant, pratiquement on définis un coefficient d avancementd Kav qui peut être déterminé facilement. V T V 0 V T -V 0 Kav = (V e V 0 ) / (V T V 0 )

37 Chromatographie par filtration sur gel V e = f(encombrement de la molécules) Molécules de même forme (masse/encombrement = K) ---> V e = f(masse) Log PM DO 280nm DOMAINE DE FRACTIONNEMENT Intervalle de taille dans lequel les substances sont fractionnées V 0 V i V e ml V e minimale des molécules exclues (V 0 ) Limite supérieure > KDa > V e optimale des molécules incluses (V i ) Limite inférieure V e

38 Chromatographie par filtration sur gel Il existe une relation linéaire entre le volume d élution (et le Kav) et le logarithme de la masse moléculaire. Log PM Log PM = f(kav) Kav = (V e V 0 ) / (V T V 0 ) DOMAINE DE FRACTIONNEMENT Intervalle de taille dans lequel les substances sont fractionnées Kav = 0 Molécules totalement exclues Kav = 0,95 Molécules totalement incluses Kav

39 Chromatographie par filtration sur gel La chromatographie par filtration sur gel peut être utilisée pour déterminer la structure oligomérique d une protéine (composition en sous-unités): masse de la protéine native ---> dénaturation---> masse des sous-unités Log PM = f(kav) La dénaturation permet de dissocier les chaînes polypeptidiques---> abolition des interactions stabilisant les structures 2 re, 3 re et 4 re. - disruption des liaison non covalentes (interactions ioniques, ponts hydrogène, interactions hydrophobes) - disruption des liaison covalentes (ponts disulfures) Urée (8M) rompt les liaisons H et hydrophobes Guanidine (6-12M) liaison H et ioniques ----O=C NH NH H 2 N=C NH NH Le dodécylsulfate de sodium (SDS) rompt les interaction hydrophobes et ioniques. Le -mercaptoéthanol et le ditiothréitol (DTT) réduisent les ponts disulfures.