Transfection chez les protozoaires

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1 Transfection chez les protozoaires Patrick Bastien FRE3013 "Biologie moléculaire et cellulaire des protozoaires parasites" CNRS / UM1 Faculté de Médecine (Institut de Botanique)

2 Introduction : les Protozoaires, les Trypanosomes, la transfection A. Transfection transitoire Intérêts Applications Plan B. Transfection stable épisomique : intérêts, aspects techniques intégrative : intérêts, aspects techniques C. Application 1 : Recherche des éléments de séquence nécessaires à la transcription et à la maturation des ARNm D. Application 2 : Étude de l expression et de la régulation d'une protéine inconnue Exemple de LmKINI2 Exemple de LmKIN1 E. Application 3 : Knock-outs, insertions et fragmentations chromosomiques

3 Les Protozoaires Intérêts Eucaryotes unicellulaires : Pathogènes +++ (paludisme, maladie du sommeil ) Modèles "simples" (souplesse, simplicité d'utilisation) mais aussi "complets" (ç unique, autonomie, stades du cycle biologique développement); animaux ( levures) Mise en évidence + facile de phénomènes complexes parfois conservés chez les eucaryotes supérieurs (accès direct) mais / et "primitifs" ou "ancestraux" Nombreuses originalités sur le plan bio.mol ou bio.cell Très grande diversité +++

4 Baldauf, Science 300, 1703 (2003) Plasmodium Toxoplasma Eimeria from yeast to man Giardia Leishmania Trypanosoma

5 Les Protozoaires Inconvénients nients Pas forcément applicable non plus aux ç animales Grande diversité aussi des machineries enzymatiques de la ç Pas de système unique pour tous les protozoaires Non-condensation des chromosomes au cours de la mitose ( taille du génome, nombre de chromosomes?) Impossibilité ou grandes difficultés à faire de la génétique classique ( ploïdie?) Plasticité génomique (ex: variations de ploïdie) Peuvent être extra- ou intra-cellulaires Obligation d'étudier des millions à la fois Séquençage des génomes +++ mais > 60 % gènes orphelins!!!! Intérêt des approches de génétique inverse

6 Les Trypanosomatidés Quelques particularités en biologie moléculaire 1 Petits génomes : Mb; paires de chromosomes (0.3 à 3.5Mb) Diploïdes, mais aneuploïdie très fréquente et bien supportée Entièrement séquencé : 8305 gènes 2 Absence d'introns 3 Organisation des gènes unique dans le monde animal : les gènes sont organisés en grandes unités de type polycistronique, situées sur un seul brin d'adn, et orientées en sens inverse

7 3 Organisation des gènes unique dans le monde animal Chomosome 1 (souche L. major Friedlin) Région répétée non codante (ADN satellites) 50 CDS 29 CDS Zone d inversion du sens de transcription

8 8305 gènes / 126 unités polycistroniques / 36 chromosomes

9 Transcription chez les Trypanosomatidés Gène du mini-exon (Spliced Leader RNA) (répété en tandem, sur chromosome 2) SL SL SL Absence de promoteurs pour RNA Pol II Transcription polycistronique uni-directionnelle ADN Transépissage Pré- ARNm AAA AAA AAA ARNm poly-adénylation 3 Pas de contrôle transcriptionnel

10 La transfection (ou transfert de gènes) = Introduction d'adn étranger dans une cellule eucaryote Intérêt pour l'étude de : Expression des gènes et régulation Mécanismes de la transcription : séquences régulatrices en cis (promoteurs etc ); maturation et stabilité des ARNm Mécanismes et séquences impliquées dans régulation Localisation et adressage des protéines Fonction des produits de gènes (gain ou perte de fonction) Analyse de régions ADN non-codantes d'intérêt pour la cellule.. But double : essentiellement étude des protozoaires (surtout parasites) secondairement applicable à l'étude de processus + ou - conservés au cours de l'évolution

11 La transfection Peut être : Homologue ou hétérologue Transitoire ou stable Episomique ou intégrative!! Souvent très similaire à la transfection des cellules mammifères in vitro Méthodes :

12 A. Transfection transitoire Flag tag Forcément épisomique GFP Gène rapporteur ( ou gène d'intérêt "taggé") Étude de l'expression pdt h Surtout utilisé pour étude séquences régulatrices Trouver le bon rapporteur! CAT, beta-glucuronidase, luciférase, beta-galactosidase Pb : efficacité variable et pas de sélection contrôler l'efficacité de la transfection (par ex. par transfection avec un 2ème gène exprimé de façon constitutive) Si pas d'introns pas besoin d'adnc; sinon, obligé! Mais possibles problèmes de clonage des gènes : génome Leishmania 63 % GC; Plasmodium 80 % AT!

13 gene A AAA AG AAA AG Gène B Gène C AAA AAA AG AAA AG CAT Plasmide AAA 5' 3' AG CAT Plasmide AAA AAA AG Longueurs minimales des régions 5' et 3 = pb

14 Étude des mécanismes de la transcription, maturation ARNm... Etude de la régulation de l'expression Etude de l'adressage des protéines?

15 B. Transfection stable = transfert de gènes transmissible à la "descendance" soit épisomique (plasmide auto-réplicatif) soit intégrative (insertion dans le génome par recombinaison homologue ++) Aspects techniques : Clonage du gène d'intérêt Construction du vecteur de transfection (cf. + loin)!! 1 vecteur spécifique pour chaque expérimentation Pb des séquences régulatrices 5' et 3' Vérifications +++ : PCR et séquençages assez long

16 B-1. Transfection stable épisomique OK chez Leishmania mais pas chez Trypanosoma Stabilité des plasmides dépend de la pression AB (ni centromères ni ORI) marqueur de sélection en + du gène inséré et des séquences régulatrices Amplification possible du plasmide en pression AB Quels marqueurs de sélection? - dominants - pas d'auxotrophie connue Antibiotiques (qui marchent!) : - neo R - hyg R - phleo R - puro R + pb des régions 5' et 3' pour chaque gène!

17 Vecteur plasmidique (exemple) insert insert

18 Expression de protéines, p. ex. de fusion Construction du vecteur par étapes successives (gène R, 5', 3' ) Clonage du gène d intérêt (ou amplification) (amorces t sites --> digestion --> purification --> ligation) Insertion dans le vecteur contenant le tag transformation de E. coli --> minipreps --> digestion pour linéariser --> transfection N.B. Autres tags possibles (Hisx6) Autres modifications possibles

19 (sur)expression d'une protéine : native, mutante, tronquée, taggée. étude de la localisation sub-cellulaire d'une protéine + adressage (et motifs impliqués) + fonction si phénotype induit... étude des séquences impliquées dans régulation de l'expression étude des modifications post-translationnelles!! Le gène "natif" est exprimé aussi! Interactions (dimérisation )

20 B-2. Transfection stable intégrative Altération permanente du génome Très facile chez les Trypanosomatidés Recombinaison homologue extrêmement efficace ( 99 % et très peu de non-homologue donc aléatoire) Manipulation du génome précise et aisée

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22 Surtout knock-out et knock-in : remplacement ou inactivation de gènes mutagenèse dirigée étude de l'expression d'une protéine dans un contexte chromosomique défini +++ étude des séquences impliquées dans régulation de l'expression!! Le gène "natif" est exprimé aussi! Interactions (dimérisation)!! si KO de gène essentiel : soit létalité (expérience négative), soit remaniement chromosomique copie supplémentaire du gène!

23 Possibilité de systèmes d'expression inductible : beaucoup + facile que chez souris car on va re-transfecter la même souche basés sur intégration du gène T7 Pol et TerR, suivi de transfection (intégrative ou non selon l'organisme étudié) avec vecteur portant 1 promoteur (PARP, rdna ), et gène R expression de fois mais 1 seul promoteur pour les 2 autre système avec deux promoteurs (dos à dos) : 1 (constitutif et non-endogène) pour le gène R et 1 (régulable) pour le gène étudié --> expression moins forte mais on peut exprimer des gènes nocifs etc

24 Possibilité aussi de systèmes + sophistiqués : ex. : pour un gène essentiel, KO des deux allèles et régulation Tet-dépendante de l'expression de la protéine à des niveaux variables à l'aide d'un promoteur T7 muté pour n'avoir que 10% de son activité (KO "conditionnels") Pour réduire le nombre de marqueurs de résistance, on peut intégrer le TetR dans le gène HYG R!

25 Aspects techniques Construction des vecteurs 1 vecteur spécifique pour chaque expérimentation Pb des séquences régulatrices 5' et 3' Vérifications +++ PCR et séquences assez long

26 Vecteur de transfection "versatile" pour knock-outs Séquence recombinante 1 Séquence recombinante 2 Site de clonage 1 Site de clonage 2 HpaI Eco57I MfeI SpeI BamHI XbaI KpnI Eco57I SP6 5 3 HYG (BLE) (NEO) (PAC) T7 Eco57I Eco57I

27 Technique de transfection la plus utilisée = électroporation Volts pendant < 1ms Mortalité immédiate 50 % 10 µg d'adn de vecteur nécessaires (versus µg en épisomique) Efficacité de transformation : Sélection obligatoire (pression AB) +++ Mortalité secondaire +++ Long (mais moins que la souris!)

28 Limitations techniques 1 Clonages cellulaires Vérifications des clones +++ : caryotype moléculaire en PFGE : (1) absence de circulaire; (2) analyse de Southern avec sonde du gène inséré --> intégration sur "bon" chromosome ; (3) analyse de Southern avec sondes très ciblées (séquences flanquantes) PCR et séquences sur ADN génomique RFLPs

29 (1) et (2) (3)

30 Limitations techniques 2 Plus compliqué quand KO des 2 (voire 3) allèles Seulement 4 marqueurs 4 transfections maxi

31 C. Application 1 : Recherche des éléments nécessaires à la transcription et à la maturation des ARNm Chez les Trypanosomatidés : Transcription en grande partie indépendante de tte séquence promotrice Inversement, aucune transcription en l'absence d'épissage Super pour l'expression en épisomique (+ loin) Super pour l'identification de séquences en cis nécessaires au trans-épissage ou à la poly-adénylation Inversement, a beaucoup compliqué l'identification de promoteurs (faux positifs)

32 Seuls promoteurs bien caractérisés = gènes de VSG et procycline, transcrits par Pol I et hautement régulés selon le stade Transfection transitoire Expression en épisomique tous les composants nécessaires à l'initiation sont présents à tous les stades incl. quand pas d'expression : donc régulation s'exerce en cis et pas due à facteurs diffusibles Toutes sortes de mutations / délétions dans régions 5' ont permis de définir les éléments de séquence nécessaires à l'activité Transfection intégrative Insertion du promoteur au locus de l'arnr --> actif dans forme où pas d'expression! idem Insertion du promoteur ribosomique dans l'unité VSG --> idem! régulation spécifique du complexe transcriptionnel recruté par le promoteur VSG Insertion (au "bon" stade) dans un locus génomique transcrit par Pol II --> pas d'expression ne peut pas recruter la Pol I dans ce contexte chromosomique Régulation épigénétique +++

33 D. Application 2 : Etude de l expression et régulation d'une protéine inconnue Transfection stable épisomique (Sur)expression en épisomique : Native Taggée (fluorophore, Hisx6 ) Mutants +++ étude de la localisation sub-cellulaire d'une protéine + adressage (et motifs impliqués) + fonction si phénotype induit... étude des motifs nécessaires à la fonction ou impliqués dans régulation post-transcriptionnelle de l'expression

34 D-1. Exemple de LmKINI2 La super-famille des kinésines Protéines d interaction avec les microtubules (MT) : rôle essentiel dans le transport intra-cellulaire Sous-famille 13 (ex-kinésines de type I) : activité de dépolymérisation des MT; domaine moteur en position interne (seul conservé); protéines impliquées dans l'assemblage du fuseau mitotique et la ségrégation chromosomique N-ter Domaine moteur C-ter KLD KEC Signal mitochondrial Site d hydrolyse des MT Site de fixation aux MT

35 Expression de protéines de fusion-gfp : LmKINI2-GFP Clonage du gène d intérêt (ou amplification) (amorces t sites) Purification Insertion dans deux vecteurs différant par la position du gène de de la GFP en 5' ou 3 fusion de la GFP en N-ter ou C-terminal

36 Expression normalement constitutive de la GFP chez les transfectants

37 LmKinI-2- GFPc Localisation au flagelle (base et extrémité) Motifs d'adressage inclus dans la séquence de la protéine

38 LmKinI-2-GFPc Induction d'un phénotype "flagelle court" et modif- n de la morphologie Aperçu sur la fonction de la protéine

39 Construction de mutants N-ter Domaine moteur C-ter KLD KEC KLD KEC GFP GFP KLD KEC

40 N-ter Domaine moteur C-ter KLD KEC Signal mitochondrial Site d hydrolyse des MT Site de fixation aux MT KLD KEC GFP GFP KLD KEC AAA KLD KLD KLD KEC AAA KEC KEC GFP GFP GFP GFP

41 LmKinI-2-GFPc-Substitution KLD/AAA

42 Longueur du flagelle Type sauvage LmKinI-2 μm 10 LmKinI-2-GFPn LmKinI-2-GFPn mutée s/ KLD 5 0 Première kinésine de type I directement impliquée dans le maintien de la longueur du flagelle ("déflagellation"?)

43 D-2. Exemple de LmKIN1 Également kinésine sous-famille 13 (type I); homologue éloigné de la MCAK (Mitotic-Centromere Associated Kinesin), localisée chez les mammifères au fuseau mitotique et aux centrosomes. Même stratégie que précédemment (transfection stable épisomique fusions-gfp)

44 LmKin1-GFP est exclusivement nucléaire LmKin1-GFP est exprimée juste avant et pendant la mitose Aperçu sur la régulation de l'expression au cours du cycle ç LmKinI1 N Mitotic spindle N Kinetoplasts N.B. Expression normalement constitutive de la GFP chez les transfectants

45 Construction de mutants N-ter Motor Domain C-ter Mutant 1 Mutant 2

46 Analyse de mutants délétionnels Regulated GFP Nter Motor Domain Cter N U C L E A R + 60 AA - Dissection of LmKIN1 : Localization and regulation depend upon the C-ter domain Characterization of a 60-aa peptide

47 Nuclear accumulation of the 60 aa-gfp mutant shows that it contains a NLS

48 1 Des substitutions par des polyalanines dans le peptide de 60 aa montrent l'existence d'une NLS 'non-canonique' dispersée TLSPSSQAKSTLVTPKPPSRDRTPDMVCTKRPRDSDRSGEDEVVARPSGRPSFKRFESGAE -AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA N C C C/N TPKPPSRDRTPDMVCTKRPRDSDRSGEDEVVARPSGRPSFKRF L'analyse par mutagenèse révèle des signaux de régulation complexes -- régulation basée sur la voie du protéasome --

49 E. Application 3 : Knock-outs et fragmentations chromosomiques Transfection stable intégrative Knock-outs (et knock-ins) sur gènes sur séquences à fonction chromosomique putative sur grandes régions chromosomiques analyse de mutants Recherche des séquences centromériques Recherche des origines de réplication

50 E-1. Exemple de la "région switch" du chromosome 1 de Leishmania 50 CDS 29 CDS Zone d inversion du sens des gènes = 1, 6 kb Région répétée non codante = satellite d'ur 272 pb = 30 kb Rôles?? - fonction centromérique? - origine de réplication? - site d'initiation de la transciption?

51 switch region 50 CDS I a 29 CDS HYG Is the switch region a centromere or a replication origin? BLE I b I c PAC 1.6 kb + The switch region is essential but not for chromosomal stability I d

52 Is it essential as the site of initiation of transcription for both gene clusters? Chr. 1a PAC SR HYG 4 clones cultivated without hygro and then with and without hygro The switch region is not essential to the transcription of the whole of the genes HYG is expressed

53 Modèle du chromosome XC290 = Mirror duplication of the subtelomeric region of inversion point chromosome 19 Tel E-2. Recherche du centromère Construction de chromosomes artificiels 145 kb 145 kb P A D A D S S D P F D H S S H AP D FPD S S D A D Tel Δ impdh 276-bp satellite Δ kin Targeted regions Δ as658 Transfection vectors HYG pvv-δimpdh HYG pvv- Δ kin HYG pvv-δas658

54 Large size deletions in chromosome XC kb 30 kb 90 kb 170 kb Transfection 260 kb H 200 kb H 120 kb H

55 PFGE analysis of the deleted chromosomes

56 Mitotic stability of the deleted chromosomes Tel Tel deletions 30 kb 90 kb 170 kb 260 kb 200 kb 120 kb 30 kb 30 kb Percentage of resistant clones % Complete maintenance Loss of stability XC260 XC200 XC days Deletion of the 30-kb intermediary region on the chromosome induces a partial loss of stability 30-kb region involved in mitotic stability Cultivation without any selection

57 Conclusions Rather origin of replication than centromere Centromere = 276-bp satellite DNA 145 kb 145 kb 276-bp satellite 30 kb 276-bp satellite

58 E-3. Recherche du centromère Construction de chromosomes artificiels A crazy idea? Modèle du chromosome 1 5 -HYG-3 5 -HYG-3

59 Extra chromosome of 155 kb (XC155) 155 kb = Stable en mitose (sans pression médicamenteuse) 155 kb

60 Analyse de clones aléatoires par RFLP et séquençage Structure du chromosome XC155 Centromere? Centromere? Construct 272 repeats kb 115 kb 20 kb

61 Quid des autres protozoaires? Les applications ne sont pas toujours aussi "aisées" : gros problème chez parasites intra-cellulaires comme Toxoplasma ou Plasmodium! Quels marqueurs de sélection? - bleo - DHFR-Pyr R - trp car auxotrophie connue au Trp La transfection est très difficile sur stades intra-ç! OK pour Toxoplasma Difficile mais possible sur P. berghei (rongeurs) Très très difficile sur P. falciparum La recombinaison homologue est peu efficace insertions aléatoires Le gène DHFR-Pyr R a même été utilisé pour mutagenèse aléatoire avec criblage par autres drogues en + pour identifier gènes de R à ces drogues Haploïde Inactivation de gènes essentiels létalité : pas de résultat donc, pas d'observation

62 CONCLUSION Les techniques de transfection ont révolutionné l'étude de la biologie moléculaire et cellulaire des protozoaires Autres applications : expression inductible, mutagenèse aléatoire, TAP-tag +++,.. Modèles eucaryotes, mais "simples" et "ancestraux" Très grande diversité d'organismes et donc de techniques, et donc d'applications Moindre intérêt pour l'homme?... pas sûr et puis

63 c'est tellement beau!..