Cancérogenèse. 6,5%: les trois mutations 38,7% une seule de ces mutations 27,1% APC et P53 61,3% P53 (chrom17)

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1 CANCER COLO-RECTAL Second cancer le plus fréquent. Âge moyen 70 ans. Plus de nouveaux cas par an 50-60% de survie à 5 ans. Au stade II: 34% de récurrences. La chimiothérapie est prescrite dans 90 % des cas

2 Cancérogenèse 6,5%: les trois mutations 38,7% une seule de ces mutations 27,1% APC et P53 61,3% P53 (chrom17)

3 Biologie moléculaire et anatomie pathologique Tout cancer est une maladie génétique gènes Dans une tumeur, il y a 100 mutations 15 sont des mutations «meneuses» qui concernent l initiation, la progression et la survie de la tumeur 80 sont des mutations «accompagnantes», reflet de l instabilité génique, sans impact thérapeutique, sans sens causal.

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5 Biologie moléculaire et anatomie pathologique Cancers sporadiques : dus à des altérations somatiques, qui s accumulent avec le vieillissement. Cancers héréditaires HNPCC 5% PAF 1% Autres CCR familiaux 9% CCR sporadiques MSI-H 15% Autres CCR sporadiques 70% Cancers sporadiques Cancers héréditaires précoces (5%; 1 personne sur 400) dus à des altérations constitutionnelles auxquelles s ajoutent des altérations somatiques.

6 Mécanismes de cancérogenèse colorectale Instabilité chromosomique: perte allélique avec inactivation de gènes suppresseurs de tumeurs : gène APC gène MYH Instabilité génétique: due à l inactivation des gènes de réparation de l ADN

7 Biologie moléculaire et anatomie pathologique Proto-oncogènes: Mutations activatrices Avec cascade de transduction du signal EGFR, RAS, PI3K Gènes suppresseurs de tumeur agissant au point de contrôle du cycle cellulaire: APC,P53 Gènes réparateurs de l ADN : MMR et MYH

8 Gènes suppresseurs de tumeur Gène APC (chromosome 5q21), très grand gène : 8,5kb mrna et 312-kD de protéine. Nombreux sites d interaction prot éine/protéine: béta-caténine, EB1, axin. Exon 15++, 10% de la partie codante (90% des mutations) dominant, pénétrance variable Gène P53 (chromosome 17), facteur de transcription, contrôlant le cycle cellulaire, en se liant à des séquences de nombreux gènes.

9 Gènes réparateurs de l ADN Système MMR MLH1 3p21.3, MSH2 2p22-p21, MSH6 2p16, PMS2 7p22 autosomale dominante, et augmente de façon importante la prédisposition au cancer du colon. Si la mutation est présente chez un homme, il a un risque de 70% à 80% de développer un cancer colorectal avant 70 ans. Si la mutation est présente chez une femme, elle a un risque de 30 à 40% de développer un cancer colorectal, et de 30 à 40% de développer un cancer de l'endomètre, avant 70 ans. Ces personnes ont également un risque de développer d'autres cancers en relation avec le syndrome HNPCC, mais avec une fréquence très inférieure. Il est donc essentiel de savoir que ce n'est pas parce qu'on porte une mutation associée au syndrome HNPCC qu'on développera avec certitude un cancer au cours de sa vie. Gène MYH (chromosome 1) chez les patients avec une polypose classique ou atténuée (>ou=20) ou/et un âge précoce de cancer colo-rectal sans polypes. Récessif: donc mutation bi-allélique (gène d excision de base, réparation des altérations de l AND par oxydation) en Y165C and G382D Wang L, Baudhuin LM, Boardman LA, Steenblock KJ, Petersen GM, Halling KC, French AJ, Johnson RA, Burgart LJ, Rabe K, Lindor NM, Thibodeau SN SO Gastroenterology. 2004;127(1):9.

10 Cancers MSI-H Caractérisés par une instabilité génétique /séquences répétées de microsatellites de l ADN 3 femmes pour 2 hommes Pronostic meilleur Plus sensibles à la chimiothérapie. Localisation colique droite Adénocarcinome mucineux de haut grade avec infiltrat lymphocytaire péritumorale.

11 Critères d Amsterdam : recherche d un phénotype MSI 2 patients atteints unis par un lien de parenté au premier degré sur deux générations, un cancer avant l âge de 50 ans. Un patient avec un cancer colo-rectal avant 40 ans et /ou un antécédent de cancer du colon ou de l endomètre. Cancer de phénotype MSI avant 60 ans. Cancer de phénotype MSI avec antécédents familial.

12 LES CANCERS MSI HNPCC héréditaire Syndrome de Lynch Occurence précoce Mutation constitutionelle Des gènes MMR hmlh1, hmsh2, hmsh6, or hpms2 COLON COLON ESTOMAC ESTOMAC ENDOMETRE Cas sporadiques Occurrence tardive Altération somatique d un gène MMR Méthylation ENDOMETRE épigénétique du promoteur de hmlh1 Ovaire, pancréas, intestin grêle, rein, cerveau,...

13 Les cancers MSI 15% des cancers colo-rectaux dus à une instabilité du génome des microsatellites (séquences répétés d ADN)/perte de la capacité de réparation des mésappariements de l ADN - par mutation des gènes de réparation (formes génétiques héréditaires) - par altération somatique d un gène de réparation : les plus fréquents. prolifération tumorale

14 Les cancers colo-rectaux de phénotype MSI sont en général dus à une perte d expression du gène hmlh1 liée à une hyperméthylation du promoteur du gène.

15 La méthylation dans l ADN normal Fonctions de la méthylation de l ADN chez les mammifères Silence transcriptionnel du gène Compaction de la chromatine Stabilité du génome Suppression des recombinaisons homologues Défense du génome Inactivation du chromosome X (femmes)

16 L hyperméthylation pathologique

17 Les allèles hyper méthylés sont clivés

18 Répartition des gènes MMR et mutations (formes héréditaires) Gène MMR LocusN. mutations(%) MSH2 2p21 (38%) MLH1 3p21-23 (49%) PMS1 2q31-33 (0.3%) PMS2 7q22 (2%) MSH6 2p21 (9%) MLH3 14q24.3 (2%)

19 Conséquences Héréditaires ou dus à une hyperméthylation : la conséquence est une instabilité des séquences de micro-satellites

20 Les séquences micro-satellites Une séquence microsatellite = répétition (au moins une trentaine de fois) en tandem de 2 à 5 nucléotides. Ces séquences peuplent le génome. = motif à deux paires de bases: CA. Fréquence= un tous les 30 à 50 kilobases. Le polymorphismes des marqueurs microsatellites=50 allèles est fonction du nombre de répétition du motif nucléotidique. La majorité = localisée dans des régions non codantes de l ADN et chez les individus normaux, très polymorphes / variation importante d un individu à un autre du nombre de répétitions qui les composent.

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23 La fidélité de la replication de l ADN détermine la stabilité du génome: 1) L ADN polymérase assure la complémentarité des bases durant la polymérisation nucléotidique. 2) Les erreurs de l ADN polymérase sont corrigées /son activité exonucléasique/édition 3)Système post-replicatif de réparation des mésappariements. Ou MMR.

24 L ADN polymérase et son activité exonucléolytique de correction 1. L ADN polymérase incorpore un nucléotide selon la sélection de base par complémentarité. 2. Le nucléotide entre et une liaison se forme. 3. L enzyme avance d un nucléotide. 4. Un mauvais appariement entraîne le retrait du nucléotide et l enzyme recule de 1 pb (tiré de Lewin, 1999). Les erreurs post-replication sont corrigés par le système MMR

25 UNE CIBLE DES ERREURS DE REPLICATIONS: les séquences microsatellites Certains de ces microsatellites sont contenus dans des séquences codantes de gènes cibles de l instabilité des cancers avec altération du système MMR.: gène TGF beta, gène du récepteur de l IGFIIR, hmsh3 et hmsh6, BAX(proapoptotique).. Instabilité= additions et pertes de bases= augmentation ou raccourcissement de la séquence.

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28 Proto-oncogènes: transduction du signal Gène KRAS, (chromosome 12), activité GTPase perdue entraine une prolifération cellulaire incontrôlée. Gène BRAF, (chromosome 7) protéine kinase

29 KRAS

30 FONTIONNEMENT DES VOIES DE SIGNALISATION RECEPTEURS à activité Tyrosine Kinase = récepteurs de facteurs de croissance ACTIVATION = phosphorylation/déphosphorylation= dénominateur commun de la transduction du signal COMMUTATEUR = petites protéines G dont RAS

31 Le pathologiste joue un rôle clé Intervient dans les conditions de fixation du prélèvement qui doivent être optimales Intervient dans le conditionnement du prélèvement pour le génotypage

32 APPLICATIONS PRATIQUES Prise en charge des formes héréditaires Marqueurs pronostiques Criblage thérapeutique et criblage des patients

33 Macroscopie

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35 Techniques de préservation La congélation tissulaire actuellement des tissu-thèques se mettent en place dans tous les laboratoires d anatomie pathologique: histoenzymologie, biologie moléculaire. La fixation doit être aussi précoce que possible et fixer le tissu dans un état aussi proche que possible de celui qu il avait in vivo. Elle préserve le tissu de la nécrose.

36 Bases morphologiques de l extraction

37 Particularités de l extraction de l ADN à partir de blocs de paraffine Des blocs de tissus sélectionnés, 2 coupes de 10µm température ambiante, mises dans un micro-tube de 2 ml.

38 Extraction de l ADN tumoral

39 Anomalies du système de réparation des erreurs de réplication de l ADN (système MMR, pour mismatch repair). Gènes MMR étudiés pour le cancer du colon : MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, hmsh6

40 Etude immunohistochimique Défaut d expression des protéines du système MMR: MLH1 MSH2 MSH6 Sensibilité moins bonne Spécificité excellente

41 ETUDE IMMUNOHISTOCHIMIQUE Les protéines nucléaires des gènes impliqués dans la réparation des mésappariements de l ADN comme hmlh1, hmsh2 peuvent être étudiées par immunohistochimie. hmsh2 hmlh1

42 hmlh1: une absence d immunomarquage par les cellules tumorales signifie une altération du gène correspondant

43 RESULTATS hmlh1 hmsh2 Tissu normal positif positif Tumeur négatif positif Perte de l expression de la protéine hmlh1 par les cellules tumorales Le résultat oriente vers l existence d une instabilité de microsatellites.

44 ALTERATION DU GENE hmlh1 1) Il s agit d un adénocarcinome du colon avec instabilité des microsatellites dû à une altération du gène hmlh1. 2) Donc il peut s agir d une forme héréditaire ou sporadique 3) Les arguments en faveur d une forme sporadique sont : - occurrence tardive - survenue chez la femme - atteinte du côlon droit

45 Technique pentaplex avec résolution en fluorescence, analyse de fragment /séquence: BAT25, BAT26, NR21, NR24 et NR27

46 PRONOSTIC / TRAITEMENT des adénocarcinomes avec instabilité des microsatellites Pronostic meilleur ce cancer serait plus sensible à la chimiothérapie : irinotecan/5fu/leucovorin

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50 Identification des mutations Discrimination allélique Amplification allèle spécifique Séquençage Classique Microséquençage Pyrosequencing Snap-shop

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53 Génotypage Principe Mésappariement Température Appariement parfait Faible Moyenne Forte

54 Génotypage: la courbe de fusion Echantillons Groupage par rapport aux témoins standards Homozygote Allèle 1 Hétérozygote allèle 1+2 Témoins calcul Homozygote allèle 2

55 Difference plot of the p.gly12ser (GGT>AGT) or c.34g>a mutation; the patient sample was one of the four KRAS mutations not initially detected by direct nucleotide sequencing (table 1). Ma E S K et al. J Clin Pathol 2009;62: by BMJ Publishing Group Ltd and Association of Clinical Pathologists

56 Comparison between direct nucleotide sequencing and HRM analysis in the detection of KRAS exon 2 mutations Direct sequencing positive HRM positive 57 4 HRM negative 1 38 Analysis of discrepant results (n = 5) Direct sequencing negative Direct sequencing HRM Sequencing of HRM product Negative Mutant positive c.34g>t Negative Mutant positive c.35g>t Negative Mutant positive c.38g>a Negative Mutant positive c.34g>a c.25g>a Negative* Not applicable *Sample categorised into the wild-type group after HRM analysis, but manual review identified difference in curve shape between the wild-type allele and the sample (fig 2). HRM, high-resolution melting.