Approche pratique de la transgénèse :

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1 Approche pratique de la transgénèse : Recherche et analyse fine d une modification génétique dans le génome murin octobre ) 2) 3) 7) 8) 9) 10) 11) 12) 13) 14) Plan / Introduction Extraction et Préparation d ADN à partir de tissus Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènes a) Southern-blot b) Dot-Blot ou Slot-Blot c) PCR Détermination du nombre de copies du transgène Détermination du site d insertion du transgène (PCR inverse) Détection et analyse de transgènes : mutation naturelle Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse additive Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse ciblée Analyse de l expression du transgène Identification des individus homozygotes Conclusions

2 2) Extraction et Préparation d ADN à partir de tissus Qualité ADN Quantité ADN Utilisation 1) Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS*, Protéinase K 55 C Overnight Purification (phénol/chloroforme) Précipitation (isopropanol) PUR Et [ ] Southern-Blot Dot-blot PCR* (destruction taq) 2) KCl, Tris-HCl, MgCl2, Tween 20, Protéinase K 55 C Overnight Précipitation (isopropanol) PUR Et [ ] Southern-Blot Dot-blot PCR - Méthodes lyses classiques : - Méthode lyse rapide (lyse alcaline) : (NaOH, EDTA) solution basique 30min à 95 C (Tris-HCl) solution acide (vol à vol) ph final neutre pas de purification, pas de précipitation** Mélange ADN / PROT PCR Pas de Southern-Blot** Pas de Dot-blot** - Autres ou méthodes commerciales PCR possible dans tous les cas d extraction car besoin d une très faible quantité d ADN

3 3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènes a) Southern-blot (E.M. Southern en 1975) Définition = détecter spécifiquement des fragments d'adn transférés sur membrane par leur hybridation à des séquences complémentaires marquées par un radioisotope (sondes) + Digestion : ADN génomique purifié + Enzyme de restriction choisie ADN digéré Choix des enzymes et sondes important et déterminant. Méthode à préférer : - Détecter le transgène - Différencier homo/hétéro - Déterminer le nb de copies - Electrophorèse : Transfert gel / membrane : Hybridation de la membrane avec une sonde Radioactive : Visualisation des sondes

4 3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènes b) Dot-blot et slot-blot Définition = détecter et quantifier un fragment d'adn donné sans digestion et séparation préalable sur gel d'électrophorèse par leur hybridation à des ADN complémentaires marqués radioisotope (sondes) - par un Principe donc très similaire au Southern-Blot Besoin aussi de grandes quantités d ADN purifié ADN fixé sur une membrane par aspiration Sondes radioactives (transgène ou transgène + vecteur) Quantification par scintillation ou par autoradiographie et densitomètre Besoin d une gamme pour quantifier = déterminer nombre de copies Besoin de témoins homo, WT et hétéro = déterminer le génotype

5 3) Les techniques de génotypage et caractérisations de transgènes c) PCR (K. MULLIS et al en 1985) PCR = Polymerase Chain Réaction (Réaction en Chaîne par Polymérase) Définition : amplifier des séquences d'adn de manière spécifique et augmenter de manière considérable la quantité d'adn dont on dispose initialement. La réalisation d une PCR nécessite - de connaître la séquence des régions qui délimitent l'adn à amplifier - des amorces oligonucléotidiques complémentaires délimitant l ADN à amplifier - l utilisation d une ADN polymérase, d amorce, et de dntp. M - Dépôt de l ADN amplifié sur un gel d agarose (électrophorèse) - Révélation de l ADN par le BET sous UV (ou autre) Limitations de la PCR pour le génotypage : - besoin de connaître la séquence des régions qui délimitent l'adn à amplifier - pb dans le cas d insertion aléatoire - Faux positif dans le cas de recombinaison homologue

6 4) Détermination du nombre de copies du transgène (Southern-blot) - Choisir une enzyme qui coupe une fois dans le transgène - Choisir une sonde à une des extrémités du transgène surtout pas au niveau du site de restriction Les cas possibles : Une intégration unique: une seule bande de taille inconnue déterminée par le prochain site de restriction dans le génome. Une intégration multiple (arrangement en Tandem) : une bande de taille attendue (ici 3,3kb) et une de taille inconnue. Une intégration multiple tête bêche et/ou queue à queue : complication du profil de migration avec apparition de bandes supplémentaires. Intégration en plusieurs sites: complication du profil de migration avec apparition de bandes supplémentaires. Southern blot sur descendance F1xWT (nb copies intégrées différents entre chaque individu donc profils différents). 4,5 kb 3,3 kb 4,5 kb 3,5 kb 3,3 kb 2,5 kb Détermination Précise du nombre de copies : - Comparaison des densités obtenues par Southern-blot pour une intégration unique versus les autres types d intégration. - Estimation du nb de copies aussi avec un Dot-blot comparant une gamme d ADN contenant un nombre de copies variables du transgène et ADN génomique

7 4) Détermination du nombre de copies du transgène (QPCR) PCR quantitative ou PCR en temps réel: Elle présente tous les avantages d une PCR avec la quantification du Blot Technologie récente, rapide, précise et non ambiguë Normalisation avec un gène de ménage (Prom CD8, Rantès, G3PDH, etc..) utilisation de courbe étalon d ADN dosé (détermination du nombre de copies) Souris Lang : ko pour le gène Langérine (intégration d un transgène avec GFP) Homo : 2 copie GFP Hétéro : 1 copie GFP Homo/hétéro Nb de copie GFP3/CD8 Nbre de copies / aux 2 copies de LANG1 GFP3/CD8 nbre de copies / aux deux copies de LANG1 60,0 2,5 2,0 51,0 50,0 1,9 2,0 40,0 1,5 1,0 1,0 1,0 30,0 GFP3/CD8 20,0 0,5 10,0 0,0 0,0 lang1 lang6 CAG-9F1 CAG-3F1 2,0 1,0 1,9 1,0 lang1 lang6 CAG-9F1 CAG-3F1 Nombre de copie n est pas toujours connu précisément mais on établie un rapport (2 fois plus donc homo) FG12-10

8 5) Détermination du site d insertion du transgène (PCR inverse) Définition = amplifier une séquence inconnue d ADN génomique à partir d'une séquence adjacente connue (exemple transgène). Techniques utilisées: La restriction enzymatique et PCR Classique Utilisation : insertion aléatoire 1) Choix de deux oligos très proches, l'un sens, l'autre antisens situés de part et d'autre d'un site de restriction unique dans le transgène à 6 nucléotides (Ici, le site B). 3) Choix d une enzyme dont le site comporte 4 nucléotides (Ici, le site A) qui coupe 1 fois dans le transgène et présent dans l ADN génomique. 5) Digestion ADN génomique avec l'enzyme A. 7) Ligation dans des conditions qui circularisent les fragments de restriction 9) Digestion ADN circularisé avec l'enzyme B. 11) PCR classique avec les primers choisis (amplification d une partie de l ADN génomique flanquant le transgène) 13) Séquençage et Comparaison des séquences dans les bases de données

9 6) Détection et analyse de transgène : mutation naturelle Phénotype Particulier qui apparaît au fil des croisements entre lignées sauvages Phénotype qui traduit un Génotype particulier Exemple : * Souris SHIVERER : Screening des souris Homozygotes (myéline) par l identification d un phénotype nerveux spécifique (tremblements) * Souris W/Wv : Screening des souris par l identification de tache blanche dans le pelage * Souris Ob : Souris anormalement Obèse découvertes dans un laboratoire américain dans les 50.

10 7) Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse additive Les fondateurs transgéniques sont identifiés uniquement par Southern-Blot et Dot-Blot et QPCR (nb copies, nb sites d insertion) méthodes décrites précédemment Utilisation possible de la PCR uniquement quand la lignée est bien établie et caractérisée (2-3 générations) attention aux risques de contamination = la seule région amplifiable est situé dans le transgène (sauf le site d insertion a été recherché) Cas particulier : si fondateur mosaïque (intégration après stade 1 = pas transgène dans toutes les cellules) risque de sous estimer le nombre de copies intégrées. détermination à réaliser plutôt sur la descendance.

11 8) Détection et analyse de transgènes issus de transgénèse ciblée Les fondateurs transgéniques sont identifiés par Southern-Blot, Dot-Blot et QPCR (nb copies, nb sites d insertion) : méthodes décrites précédemment Association d une sonde externe et interne pour le Southern-Blot : complète le profil (nouvelles bandes) confirme la recombinaison homologue détermination de l homozygotie et hétérozygotie (décrit postérieurement) Utilisation de la PCR est recommandée et possible rapidement (génération F1) : recombinaison homologue = ADN génomique flanquant parfaitement connu risque de PCR de grande taille supérieure à 2 ou 3 Kb (dépends taille de la région d homologie et du transgène) détermination simple de l homozygotie et hétérozygotie (décrit postérieurement)

12 9) Analyse de l expression du transgène La plus part des stratégies de transgènèse mis en place ont pour but de caractériser l expression du transgène : Soit directement en reconnaissant la protéine issue de l expression du transgène par des techniques classiques comme le western-blot, l ELISA ou l imunohistochimie. Soit indirectement - en reconnaissant des «tags reporters» associé aux protéines d intérêt (protéine-gfp) - simplement en joignant un gène rapporteur (LacZ ou GFP) à la région codante d un gène d interrêt grace à une séquence IRES. Le gène LacZ codant pour la β-galactosidase, enzyme qui hydrolyse un substrat (X-Gal) en un produit coloré bleu. fixation préalable des tissus et ne peut donc pas être employé pour marquer des cellules vivantes. Le gène codant pour la GFP (green fluorescent protein) qui émet une fluorescence verte sous UV et son variant l EGFP (meilleure thermo stabilité et une fluorescence accrue). Contrairement au gène LacZ, la visualisation de la GFP ne nécessite ni fixation du tissu, ni substrat chromogène. Gène rapporteur adapté pour suivre l expression d un transgène dans des cellules vivantes ou dans la souris entière

13 10) Identification des individus homozygotes Par dosage de la quantité de transgène: - Southern blot : sonde interne et externe au transgène - Dot-Blot ou slot Blot : comparaison avec intensité de bande de WT, +/- et -/- PCR quantitative ou PCR en temps réel Par quantification du produit du transgène ou du phénotype: -Avec LacZ ou GFP, la vitesse et l intensité de coloration ou de fluorescence sert d indicateur de l homozygotie (à confirmer par la méthode du test de reproduction) - Détection du doublement de la quantité du produit du gène chez les homozygotes : Exemple : Expression de molécules à la surface des cellules du sang périphérique à l aide d anticorps fluorescents, suivi de l analyse par cytometrie en flux M1 M1 : 437 Témoin: Homozygote M1 M1 : 292 Hétérozygote M1 < témoin M1 M1 : 442 Homozygote M1 =ou> témoin Lignée F5 : chaîne α et β du TCR Anticorps anti Vβ11 = chaîne β du TCR M1: intensité moyenne de fluorescence

14 10) Identification des individus homozygotes (Suite) Par hybridation in situ pendant l interphase du noyau : Sondes biotinylées, détection enzymatiques ou fluorescentes Par test de reproduction : PCR du transgène sur F1 (fondateur X WT) 100% des individus positif : fondateur homo sinon hétéro et/ou WT Obligation de croiser un nombre élevé d individus et sur plusieurs générations cher, perte de temps et possibilité d erreur. Par PCR si connaissance du site d insertion du transgène : 100pb WT sens Wild type WT antisens WT sens GENE RAPPORTEUR Mutant +/+ +/- -/- M Ko sens 200pb 100pb WT sens W ildtype WT antisens WT sens 200pb 100pb GENE RAPPORTEUR 200pb Ko sens Mutant WT antisens?

15 11) Conclusions Southern Blot : technique ancienne mais qui a fait ces preuves Utilisable dans tous les cas de figures Longue et difficile à mettre en œuvre Besoin de radioactivitée Recombinaison homologue Nb de copies Site d intégration Homo/hétéro Dot blot : technique proche du Southern-blot Plus facile à mettre en œuvre Screening rapide Besoin de radioactivitée Homo/hétéro Nb de copies (si faible difficile à déterminer = mauvaise discrimination) PCR : Technique Moderne et rapide Facile à mettre en œuvre Oblige à connaître les séquences à amplifier Plus limitée pour la détermination des homo/hétéro Détermination du site d intégration (ipcr) Cas particulier QPCR : nb copies et homo/hétéro par combinaison PCR et quantification Expression du transgène : Facile à mettre en œuvre et rapide Résultats oui/non et/ou homo/hétéro Très complémentaire des autres techniques

16 ANNEXE : Lyse alcaline Préparation tampon de lyse alcalin SOL A solution mère NaOH 0,5M (1000mg ds 50ml) EDTA 200mM H20 vol solution mère µl mm 0,2 mm qsp (ml) 10 C finale 100 µl sol A le doigt doit tremper (centri) 95 c 30min secouer avec le doigt ou vortexer pour améliorer dissolution SOL B solution mère Tris HCL 1M ph 5 H20 100µl sol B centri vortex conservation 4 C vol solution mère µl 40 mm qsp (ml) 10 C finale