Premières expériences de diagnostic des formes héréditaires de cancer du sein et de l ovaire sur séquenceur Illumina GAIIx

Transcription

1 Premières expériences de diagnostic des formes héréditaires de cancer du sein et de l ovaire sur séquenceur Illumina GAIIx 1 / 35

2 2 / 35

3 Contexte 3 / 35

4 Risque cumulé de cancer à 70 ans Cancer du sein Cancer de l ovaire Femmes porteuses d une mutation de BRCA1 60% 40% Femmes porteuses d une mutation de BRCA2 40% 10% Population générale 10% 1% Antoniou et al.am.j.hum.genet. 72,2003 : / 35

5 MP : Mutations Ponctuelles RGT : Réarrangements de grande taille 5 / 35

6 décembre 2011 Comment augmenter le nombre de mutations identifiées? Les mutations non identifiées de BRCA1 et 2. Les mutations dans d autres gènes. 6 / 35

7 Remaniements génomiques Ruibin Xi, BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS. VOL 9. NO ^ 415 Bruno Zeitouni, BIOINFORMATICS APPLICATIONS NOTE Vol. 26 no , pages / 35

8 Autres gènes William D. Foulkes, N Engl J Med 2008;359: / 35

9 9 / 35

10 10 / 35

11 Le projet CASO V1 Méthodologie : 3 runs de validation Run 1 : 12 échantillons connus mutés pour BRCA1/2 multiplexage avant/après capture-par 6 ou 12 Run 2 : validation sur 48 échantillons supplémentaires Run 3 : run de validation en aveugle Outils bioinformatiques (analyse de BRCA1 et 2) CASAVA 1.8 GenomeStudio (Illumina) Genomics (CLCbio) NextGENe (Softgenetics) CNV-seq 11 / 35

12 CASO V1: gènes capturés 12 / 35

13 CASO V1 Sample prep Capture SureSelect (Agilent Technologies) 13 / 35

14 CASO V1 : Sample prep Primer Barcode DNA Adaptateur Barcode 14 / 35

15 CASO V1 : Sample prep Séquençage paired-end 2x76 pb Primer de séquençage Barcode DNA Barcode Primer de séquençage 15 / 35

16 CASO V1 - Run 1 12 échantillons Gène Exon/Intron HGVS c. Index BRCA1 Del 1-24 c.1-?_5592+?del CAACCT BRCA1 Dup 5-7 c.135-?_441+?dup AACCAT BRCA1 Ex 11 c.2612_2613inst AATTAT BRCA1 Dup 13 c.4186-?_4357+?dup ACACAT BRCA1 Ex 13 c.4282ins39 GCATGT BRCA1 Ex 18 c.5077_5082del6ins12 CCCCCT BRCA2 Ex 9 c.736_755del20 TCGATT BRCA2 Ex 10 c.1231del11ins4 CGATCT BRCA2 Ex 12 c.6848c>a TGCATT BRCA2 Ex 14 c.7069_7070delct AGCTAT BRCA2 Ex 23 c.9097dupa GGTTGT BRCA1 Ex 11 c.1175_1214del40 AAGGAT 16 / 35

17 CASO V1 - Run 1 Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4 17 / 35

18 CASO V1 - Run 1 : résultats Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4 Nb d échantillons Nb reads (millions) On/off target (CASAVA) On/off target (NextGENe) Couverture (on target) Couverture (exons) % 17% 16% 18% 29% 35% 34% 37% / 35

19 CASO V1 - Run 1 : résultats BP : break point 19 / 35

20 CASO V1 - Run 1 : résultats 20 / 35

21 CASO V1 - Run 2 21 / 35

22 CASO V1 - Run 2 Gène Réarrangements de grande taille BRCA1 c.1-?_80+?del (del exon 2) 15 RGT (13 BRCA1, 2BRCA2) 13 délétions emportant de 1 exon à la totalité du gène. 2 duplications BRCA1 c.671-?_4185+?del (del exon 11-12) BRCA1 c.81-?_134+?del (del exon 3) BRCA1 c.442-?_4357+?del (del exon 8-13) BRCA1 c.81-?_4986+?del (del exon 3-16) BRCA1 c.442-?_4357+?del (del exon 8-13) BRCA1 c.135-?_5592+?del (del exon 5-24) BRCA1 c.4987-?_5074+?del (del exon 17) BRCA1 c.81-?_547+?dup (dup exon 3-8) BRCA1 c.5333-?_5406+?del (del exon 22) BRCA1 del NBR2-exon1a-1b BRCA1 c.5278-?_5332+?del (del exon 21) BRCA1 c.5194-?_5277+?del (del exon 20) BRCA2 c.6842-?_7007+?del (del exon 12-13) BRCA2 c.156_157insalu exon 3 22 / 35

23 CASO V1 - Run 2 14 indels dans BRCA1 de 1 à 16 pb Gène BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 BRCA1 Insertions/délétions c.3481_3491 del11 c.3947_3950deltctt c _59dup12 c.3731_3738del8 c dupa c.282_288dupgcttgac c.2709_2710deltg c.1016dupa c.3770_3771delag c.3541_3556del16 c.4391_4393delctainstt c.5077_5082del6ins12 c.2269delg c.3839_3843del5ins4 23 / 35

24 CASO V1 - Run 2 14 indels dans BRCA2 de 1 à 7 pb Gène BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 BRCA2 Insertions/délétions c.9435_9436delgt c.5272_5274delaat c.7795_7797delgaa c _681+98delgt c.1389_1390delag c.8053dela c.1796_1800del5 c.6408_6414del7 c.635_636delga c.6079dupa c.9699_9702del4 c.755_758del4 c.5810_5811delct c.8773_8780dup7 24 / 35

25 CASO V1 - Run 2 9 mutations ponctuelles dans BRCA1 et 2 Gène Variation génomique Variation protéique BRCA1 c.213-1g>a P.? BRCA1 c.3979c>t p.gln1327x BRCA2 c.516+2t>c P.? BRCA2 c.7007g>a P.? BRCA2 c.1395a>c p.(=) BRCA2 c.6848c>a p.pro2283his BRCA2 c.7558c>t p.arg2520x BRCA2 c.8707g>t p.glu2903x BRCA2 c.273c>a p.tyr91x 25 / 35

26 CASO V1 - Run 2 : résultats Lane 1 Lane 2 Lane 3 Lane 4 Lane 5 Lane 6 Lane 7 Lane 8 Nb d échantillons Nb reads (millions) On/off target (CASAVA) On/off target (NextGENe) Couverture (on target) Couverture (exons) % 42% 42% 44% 42% 42% 41% 39% 83% 80% 79% 83% 81% 82% 76% 74% / 35

27 Run 2 - résultats : sensibilité Type de mutation Attendus Observés Sensibilité RGT* 15 15* 100% Indels % Mutations ponctuelles % (*) c.156_157insalu de 350 pb dans l exon 3 de BRCA2 n est pas mise en évidence par CNVSeq mais CASAVA montre un point de cassure et NextGENe une suite de mutations ponctuelles 27 / 35

28 Run 2 - résultats : spécificité Type de mutation Observés Attendus Spécificité RGT % NextGENe Non filtré (Exons +/- 50 pb) Filtré (Exons +/- 50 pb) Type de mutation Observés Attendus Observés Attendus Indels et Mutations ponctuelles Données filtrées : Score 7,0 (score des variations contiguës s'additionnent), % allèle muté 20% 28 / 35

29 BRCA2 c.8707g>t 29 / 35

30 BRCA2 c.156_157insalu (350 pb) 30 / 35

31 BRCA2 c.156_157insalu 31 / 35

32 Le projet CASO V1 - Run 3 88 échantillons + 8 témoins positifs : BRCA1 : c.5077_5082del6ins12 BRCA1 : c.1175_1214del40 BRCA1 : c.4987-?_5074+?del (del exon 17) BRCA1 : c.4176-?_4357+?dup (dup exon 13) BRCA1 : c.5333+?_5406+?del (del exon 22) BRCA1 : c.4282ins39 BRCA1 : c.1232deltacccctattginsacat BRCA2 : c.156_157insalu En aveugle / dhplc + HRM + Sanger + MLPA + QMPSF 32 / 35

33 Conclusion Le séquençage de nouvelle génération est utilisable pour le diagnostic moléculaire en oncogénétique. (Sensibilité 100%, excellente spécificité) Le multiplexage des échantillons avant capture est pertinent ; il permet de réduire sensiblement les coûts et de simplifier la capture de séries importantes. Cette stratégie nous permettra d étendre le diagnostic aux autres gènes impliqués dans les prédispositions aux cancers du sein et/ou de l ovaire. 33 / 35

34 Conclusion (problèmes en suspend) Choix des gènes à capturer pour CASO V2 (ratio : nb de gènes/couverture) Analyses des autres gènes : Filtrage des données Analyses des variants Pb éthiques TP53 34 / 35

35 Jean-Jacques Baumann Agnès Hardouin Sophie Krieger Angélina Legros Olivier Letac Antoine Rousselin Toute l équipe du LBCO Pr Thierry Frébourg, Isabelle Tournier et toute l équipe de l U614 Marie-Claire King et Tom Walsh Dons et legs Corinne Cruaud du Génoscope 35 / 35