Purification de protéines - stratégies

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Raymond Beauchemin
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1 Purification de protéines - stratégies Propriétés des protéines et stratégie de purification Instabilité à la température Stabilité au ph Stabilité au solvants organiques Nécessité d utiliser des détergents Sel (force ionique) Co-facteur et stabilité d activité Sensibilité aux protéases Sensibilité aux métaux Activité redox Poids moléculaire Charge Affinité biospécifiques Modifications post-traductionelles Hydrophobicité 1

2 Purification de protéines - stratégies Définir la pureté nécessaire 99% Utilisation thérapeutique, études in vivo 95-99% Cristallographie, caractérisation physico-chimiques < 95 % Antigène pour production d anticorps, séquençage d Edman Minimiser les étapes de purification Pureté Préparation Extraction, clarification Purif. Interm. Enlever les impuretés Capture Isoler, concentrer et stabiliser Finition Haute pureté Étapes 2

3 Purification de protéines - stratégies Étapes de purification Echange d ion Interaction hydrophobique Affinite Exclusion Phase inverse Amersham Biosciences Protein Purification Handbook

4 Principe de séparation Concentration de proteines de charge opposee Gradient de force ionique et déplacement de protéine faiblement associée à la résine Elution progressive des protéines avec l augmentation du gradient de force ionique 4

5 Types de résines Résine Groupes fonctionnels ph oper. Anion Diethylaminoethyl -O-CH 2 -CH 2 -N + H(CH 2 -CH 3 ) Amino ethyl quaternaire -O-CH 2 -CH 2 -N + H(C 2 H 5 ) 2 CH 2 -CHOH-CH Ammonium quaternaire -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -N + (CH 3 ) Cation Carboxymethyl -O-CH 2 -COO Methyl sulfonate -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -SO Sulfopropyl -O-CH 2 -CHOH-CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -CH 2 SO

6 Sélection selon le pi de la protéine Charge nette pi Gamme de stabilité Courbe de titration théorique 6

7 Sélection du ph et ordre d élution résine échangeuse de cation ph acide inférieur aux pi des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeuse de cation ph basique supérieur aux pi des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeuse d anion. ph moins acide. Une protéine negativement chargée(bleu) interagit avec la résine anionique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuvent etre séparées avec une résine anionique, alors que la protéine en bleu n est pas retenue. résine échangeuse d anion ph moins basique. Une protéine positivement chargée (rouge) interagit avec la résine cationique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuvent etre séparées avec une résine anionique, alors que la protéine en rouge n est pas retenue. 7

8 Force ionique et facteur de capacité lysosyme α-chymotrypsinogen Ln(k ) Cytochrome C 1/ I ou: A p : Aire du polyelectrolyte σ p : Densité de charge F : Constante de Faraday ε 0 : Cst. Permittivité ε r : Cst dielectrique de la phase mobile I : Force ionique Φ: Rapport volume occupé par phase stationnaire et mobile: V s /V m Anal. Chem, 63, 1867 (1991) 8

9 Sélectivité et élution Gradient linéaire Elution par plateau 9

10 Diamètre des particules et résolution Amersham Biosciences Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods

11 Caractéristiques des résines 11

12 Tampons Purifying proteins for proteomics R.J. Simpson, p

13 Exemples de séparation Anion (faible) Anion (fort) Anion (fort) Amersham Biosciences Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods Anion (faible) 13

14 Exemples de séparation Résine échangeuse de cation Amersham Biosciences Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing Principles and Methods

15 15

16 Chromatographie d exclusion moléculaire Phase stationnaire : pores de taille contrôlée Gels (agarose, dextrane, polyacrylamide) Supports rigides (silice poreuse) Phase mobile Solubilise l échantillon Gonfle le gel Compatible avec le système de détection Isocratique Ex : TRIS, phosphate, NaCl, et detergent neutre Séparation basée sur la taille des molécules, et donc leur aptitude à pénétrer dans le réseau de pores 16

17 Chromatographie d exclusion moléculaire 17

18 Chromatographie d exclusion moléculaire Gel, structure et porosité Structure de polyacrylamide Harris, 6 e Ed. p

19 Chromatographie d exclusion moléculaire Coefficient de distribution et masse moléculaire V 0 V i V m V R = V 0 + K D V i K D = V R V 0 V m V 0 Volume mort, V 0 est determiné en utilisant le dextran blue 2000 (Mr = 2 x 10 6 Da). Vm correspond au volume de la phase mobile et est la somme du volume mort et du volume interne V i. 19

20 Chromatographie d exclusion moléculaire Exemple de séparation L ordre d élution est inversement proportionel à la masse moléculaire. Utilité pour l observation et le contrôle du repliement et de l aggrégation de protéines. Frequemment utilisée pour désaler les protéines par exemple après digestion ou modification chimique. Harris, 6 e Ed. p

21 Chromatographie d exclusion moléculaire Gamme de linéarite Diamètre des pores de la phase stationnaire de polystyrene Harris, 6 e Ed. p. 653 Pour chaque phase stationnaire il existe un domaine ou le log Mr et le volume d élution est linéaire. La gamme de masse augmente avec la dimension des pores (Ex: G2000SW, pore 13 nm, separation: kda et G5000SW, pore 100 nm, separation > 1.5 MDa) 21

22 Chromatographie d exclusion moléculaire Tampons volatils recommandés ph Tampons Contre-ion pk-pour tampon 2.0 Formic acid H Pyridine/formic acid HCOO ; Trimethylamine/formic acid HCOO ; Pyridine/acetic acid CH 3 COO ; Trimethylamine/acetic acid CH 3 COO ; Trimethylamine/HCI CI Ammonia/formic acid HCOO ; Ammonia/acetic acid CH 3 COO ; Trimethylamine/carbonate CO ; Ammonium bicarbonate HCO ; Ammonium carbonate/ammonia CO ; Ethanolamine/HCI CI Ammonium carbonate CO ;

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