Analyse protéomique différentielle par spectrométrie de masse: exemple de l'icpl. (Isotope Coded Protein Label) Emmanuelle Com

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1 Analyse protéomique différentielle par spectrométrie de masse: exemple de l'icpl (Isotope Coded Protein Label) Emmanuelle Com Plate-forme protéomique Biogenouest, Rennes 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 1

2 L analyse différentielle en protéomique Sur gel Approche classique 2D-DIGE (Differential Gel Electrophoresis) Sur puces à protéines La technologie ProteinChip SELDI-TOF (Lucid proteomics) Par spectrométrie de masse Le marquage isotopique L analyse sans marquage («label-free) 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 2

3 Principe général de la quantification relative de protéines par spectrométrie de masse par marquage isotopique Objectif : comparer la composition protéique d échantillons biologiques. Principe : marquage des échantillons à comparer avec des composés différentiables par spectrométrie de masse et de mêmes propriétés physico-chimiques : isotopes stables 2 H, 13 C, 15 N, 18 O etc. recherche des pics avec un écart de masse précis sur un même spectre quantification relative par intensité des pics Champs d application : protéines cytosolubles, membranaires, sécrétées. échantillon 1 Marquage échantillon 1 Marquage Mélange des échantillons marqués Analyse par MS intensité m/z échantillon 2 Marquage échantillon 2 m/z Quantification relative par MS 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 3

4 Principales méthodes de quantification relative de protéines par spectrométrie de masse par marquage isotopique Méthodes de marquage des protéines : marquage métabolique SILAC (Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Culture) marquage chimique ICAT (Isotope Coded Affinity Tag) ICPL (Isotope Coded Protéine Labeling) Protéines Digestion enzymatique Méthodes de marquage des peptides : marquage chimique itraq (isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation) TMT Technology (Tandem Mass Tag) marquage enzymatique 18 O Peptides 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 4

5 SILAC : marquage métabolique des protéines Culture cellulaire en présence d acides aminés (Lys et Arg) marqués par des isotopes stables: incorporation des acides aminés alourdis Mélange des échantillons Sous-fractionnement possible par séparation sur gel 1D Digestion des protéines Séparation des peptides par LC-MS/MS Analyse MS : quantification relative par mesure de l intensité des pics des différents échantillons Analyse MS/MS : identification Comparaison jusqu à 5 échantillons (Molina H. et al., 2009, J Proteome Res) D après Harsha HC. et al., 2008, Nat Protocols D après Harsha HC. et al., 2008, Nat Protocols 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 5

6 ICAT: marquage chimique des protéines Marquage des cystéines des protéines par un composé léger ou lourd Mélange des protéines des échantillons Sous-fractionnement possible Digestion des protéines Enrichissement des peptides marqués par colonne d affinité Avidine Séparation des peptides par LC-MS/MS Analyse MS : quantification relative Analyse MS/MS : identification Comparaison limitée à 2 échantillons D après Shiio Y. & Abersold R., 2006, Nat Protocols 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 6

7 ICPL: marquage chimique des protéines Marquage des lysines et NH 2 term des protéines par un composé dérivé de l acide nicotinique X= 12 C ou 13 C et/ou H ou 2 H Marqueur ICPL Da Groupe réactif Mélange des protéines des échantillons Sous-fractionnement possible Digestion des protéines Séparation des peptides par LC-MS/MS Analyse MS : quantification relative Analyse MS/MS : identification Comparaison jusqu à 4 échantillons 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 7

8 itraq: marquage chimique des peptides Digestion en parallèle des protéines des échantillons Marquage des amines libres des peptides par un tag isobarique MS/MS Ions rapporteurs = Quantification relative MS Ions de = Identification séquence Mélange des peptides des échantillons Analyse MS : tag isobarique = même m/z pour un même peptide des différents échantillons Analyse MS/MS : quantification relative et identification Comparaison jusqu à 8 échantillons D après Ross et al., 2004, Mol. Cell. Proteomics 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 8

9 TMT: marquage chimique des peptides Digestion en parallèle des protéines des échantillons Marquage des amines libres ou cystéines des peptides par un tag isobarique Mélange des peptides des échantillons Analyse MS : tag isobarique = même m/z pour les mêmes peptides des différents échantillons Analyse MS/MS : quantification relative et identification Comparaison jusqu à 6 échantillons Specific enrichment of cystmt-labeled peptides. 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 9

10 Marquage 18 O: marquage enzymatique des peptides Digestion enzymatique des protéines Marquage du résidu C-term des peptides par 2 atomes 18 O : réalisé dans l eau lourde H 2 18 O et catalysé par l enzyme Mélanges des peptides des échantillons Séparation des peptides par LC- MS/MS Quantification relative en MS : mesure de l intensité des pics des différents échantillons Comparaison limitée à 2 échantillons D après Fenselau C. et al., 2007, J. Chromatogr. B 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 10

11 Bilan : avantages et inconvénients SILAC SILAC pas de marquage chimique, moins de biais techniques limité aux cellules en culture se divisant ICPL ICAT itraq TMT 18 O ICAT purification des peptides marqués marquage des cystéines (abondance relative 1,5%) ICPL sous-fractionnement (mélanges complexes, isoformes, etc.) marquage des lysines (abondance relative 6%) itraq marquage de tous les peptides peu de sous-fractionnement, marquage tardif TMT marquage de tous les peptides ou purification peu de sous-fractionnement, marquage tardif D après Bantscheff M. et al., 2007, Anal. Bioanal. Chem. 18 O marquage facile de tous les peptides risque de marquage partiel, analyse complexe 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 11

12 Développement de l utilisation de l ICPL Objectif : développer une méthode de quantification relative par ICPL efficace comparer les résultats obtenus avec deux types de spectromètres de masse : MALDI-TOF-TOF et ESI-ITMS Source d ionisation : MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) Analyseur : TOF-TOF (Time-Of-Flight- Time-Of-Flight) Source d ionisation : ESI (Electrospray ionization) Analyseur : ITMS (Ion Trap Mass Spectrometry = trappe d ions) MALDI-TOF-TOF UltraFlex Bruker Analyse WarpLC Biotools ESI-ITMS HCT Ultra Bruker 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 12

13 ICPL en MALDI-TOF-TOF échantillons marqués ICPL combinés Fractionnement par gel 1D Digestion des protéines en gel (trypsine) Ultimate 3000 Dionex Séparation par nanolc temps de rétention Dépôt sur cible MALDI Quantification relative intensité L m/z H Analyse MS Protéineeer FC m/z Identification des protéines L H Analyse MS/MS MALDI-TOF-TOF (UltraFlex) Analyse par spectrométrie de masse flux LC spot de calibration Prespoted Anchor Chip 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 13

14 ICPL en ESI-ITMS échantillons marqués ICPL combinés Fractionnement par gel 1D Digestion des protéines sur gel (trypsine) Ultimate 3000 Dionex Séparation par nanolc temps de rétention Quantification relative intensité L m/z H Analysis MS Analyse MS en ligne m/z L Identification des protéines H Analyse MS/MS ESI-ITMS HCT Ultra 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 14

15 Test du protocole ICPL Echantillon test ICPL duplex : Protéines standards Echantillon test 1 Echantillon test 2 Ratio H/L BSA 13.5 µg 13.5 µg 1:1 Ovalbumine 24 µg 6 µg 1:4 Carbonic anhydrase II 12 µg 24 µg 2:1 Marquage L Marquage H Mélange des 2 échantillons Analyse par LC-MALDI-TOF-TOF Analyse par LC-ESI-ITMS 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 15

16 Présentation des résultats de quantification et d identification en MALDI-TOF-TOF Espèces monochargées 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 16

17 Présentation des résultats de quantification et d identification en ESI-ITMS Chromatogramme d ion extraits Intens. x Léger Lourd Espèces multichargées Intensité Time [min] EIC ; ; ; ; ; ; ; All MS, Smoothed (2.27,1,GA) Time EIC ; ; ; ; ; ; ; All MS, Smoothed (2.27,1,GA) 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 17

18 Résultats de l expérience test Protéines standards Appareil Peptides identifiés Paires de peptides marqués Ratio H/L expérimental Ratio H/L théorique BSA MALDI-TOF-TOF / ESI-ITMS / Ovalbumine MALDI-TOF-TOF / ESI-ITMS / Carbonic anhydrase II MALDI-TOF-TOF / ESI-ITMS / Bonne précision des ratios H/L calculés à partir de plusieurs valeurs en particulier en MALDI-TOF-TOF Temps d analyse beaucoup plus court en ESI-ITMS 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 18

19 Application à des échantillons réels : «Rôle des microarns dans la spermatogenèse chez la souris» Serge Nef, Université de Genève PAPAIOANNOU MD, LAGARRIGUE-REBOUTIER M, et al. Sertoli cell loss of Dicer causes significant alterations at the proteome level. Molecular & Cellular Proteomics. In Press Testicules de souris sauvages Marquage ICPL Echantillons marqués par ICPL combinés Digestion enzymatique sur gel Testicules de souris mutante (KO Dicer) Sous-fractionnement sur gel 1D ESI-ITMS HCT Ultra Quantification relative et Identification Analyse MS en ligne UltraFlex MALDI-TOF-TOF Dépôt sur cible MALDI Séparation par nanolc Ultimate 3000 Dionex 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 19

20 Comparaison des protéines identifiées MALDI-TOF-TOF MALDI-TOF-TOF 5 8 ESI-ITMS ESI-ITMS bande 1 bande 2 MALDI-TOF-TOF MALDI-TOF-TOF ESI-ITMS ESI-ITMS bande 3 bande 4 Le nombre de protéines identifiées en ESI-ITMS semble être plus important qu en MALDI-TOF-TOF Complémentarité des identifications obtenues en MALDI-TOF-TOF et en ESI-ITMS 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 20

21 Comparaison des peptides identifiés Peptide identifié avec l UltraFlex Peptide identifié avec l HCT Ultra MRECISIHVG QAGVQIGNAC WELYCLEHGI QPDGQMPSDK TIGGGDDSFN TFFSETGAGK HVPRAVFVDL EPTVIDEVRT GTYRQLFHPE QLITGKEDAA NNYARGHYTI GKEIIDLVLD RIRKLADQCT GLQGFLVFHS FGGGTGSGFT SLLMERLSVD YGKKSKLEFS IYPAPQVSTA VVEPYNSILT THTTLEHSDC AFMVDNEAIY DICRRNLDIE RPTYTNLNRL IGQIVSSITA SLRFDGALNV DLTEFQTNLV PYPRIHFPLA TYAPVISAEK AYHEQLSVAE ITNACFEPAN QMVKCDPRHG KYMACCLLYR GDVVPKDVNA AIATIKTKRT IQFVDWCPTG FKVGINYQPP TVVPGGDLAK VQRAVCMLSN TTAIAEAWAR LDHKFDLMYA KRAFVHWYVG EGMEEGEFSE AREDMAALEK DYEEVGVDSV EGEGEEEGEE Y Les peptides identifiés en MALDI-TOF-TOF et en ESI-ITMS peuvent être très différents Le recouvrement de séquence d une protéine peut être augmenté en utilisant les deux techniques 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 21

22 Comparaison des ratios H/L MALDI-TOF-TOF ESI-ITMS H/L SD H/L SD Protéine Bande 1 Protéine Protéine Protéine Protéine Bande 2 Protéine Protéine Protéine Bande 3 Protéine Protéine Protéine Bande 4 Protéine Protéine Pour les protéines communément identifiées avec les deux techniques, les ratios H/L sont très cohérents Dans certains cas, une seule technique a permis de calculer un ratio H/L 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 22

23 Application à des échantillons réels : «Rôle des microarns dans la spermatogenèse chez la souris» Serge Nef, Université de Genève PAPAIOANNOU MD, LAGARRIGUE-REBOUTIER M, et al. Sertoli cell loss of Dicer causes significant alterations at the proteome level. Molecular & Cellular Proteomics. In Press, doi: /mcp.m mcp protéines identifiées en ESI-ITMS dont 168 non redondantes Quantification pour 130 protéines 50 protéines up-régulées Validation des ratio d expression pour 6 protéines d intérêt Protéine H/L ICPL H/L AQUA Annexin A2 1,78 1,87 Vimentin 1,69 1,93 Superoxide dismutase ATP synthase subunit delta 1,68 1,44 1,52 1,78 GST Mu1 0,85 0,86 Peroxiredoxin 1 1,18 1,3 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 23

24 L analyse multiplexe: ICPL quadriplex Marquage des lysines et NH 2 term des protéines par un composé léger, moyen, lourd ou super-lourd 105 Da 109 Da 111 Da 115 Da Léger (L) Moyen (M) Lourd (H) Super-Lourd (SH) Faible différence de masse entre le moyen et le lourd (2Da) Chevauchement des massifs isotopique moyen et lourd Application possible en ESI-ITMS? + 4 Da + 2 Da + 4 Da ELISNSSDALDKIR intensité RelativeAbundance m/z m/z 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 24

25 Evaluation de la précision de mesure de l ICPL quadruplex en ESI-ITMS Marquage d un même échantillon biologique complexe (lysat cellulaire) avec les 4 composés ICPL (1:1:1:1) Surestimation de la valeur du peptide marqué avec le composé lourd Correction par la normalisation des ratios protéiques (facteur de normalisation = ratio médian) 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 25

26 Application à des échantillons réels : «Caractérisation de zones différentes d un tissu cancéreux : le projet Glioma Grand Ouest» Philippe Menei, CHU Angers Echantillons 26 patients inclus dont 23 glioblastomes confirmés Quantité suffisantes de protéines pour 12 patients dans 3 zones minimum Difficulté pour la zone nécrotique Analyse réalisée sur 6 patients (2 avec 4 zones à analyser et 4 avec trois zones) Origines différentes et analysables en transcriptomique Stratégie expérimentale Patients à 3 zones (ZMN, ZI et ZT): alternance du marquage (L, M, H) Patients à 4 zones (ZMN, ZI, ZT et ZN): utilisation d un standard interne et alternance de marquage Préfractionnement sur gel 1D Découpe de 20 bandes et analyses nanolc-ms/ms de chacune des bandes (ESI-ITMS) 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 26

27 Triplex ICPL en ESI-ITMS Résultats bande 18 Protéine identifiée : Histone H3.3 (21 peptides identifiés) ratio H/L : 4.7 +/- 0.4 (CV 16.83%) calculé sur 4 paires ratio M/L : / (CV 15.88%) calculé sur 6 paires ratio H/L : / (CV 20.90%) calculé sur 6 paires 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 27

28 Bilan résultats protéomique Protéines non redondantes validées 270 protéines non redondantes chez tous les patients 215 protéines avec des données de quantification chez au moins un patient Protéines différentielles ZI/ZMN ZT/ZMN ZN/ZMN ZT/ZI ZN/ZI ZN/ZT total < 0,7 >1,5 total < 0,7 >1,5 total < 0,7 >1,5 total < 0,7 >1,5 total < 0,7 >1,5 total < 0,7 >1,5 patient patient patient patient patient patient Gradient d expression protéique: ZT > ZI > ZMN (> ZN) Annotation fonctionnelle des protéines différentielles: constituants du cytosquelette, transport et localisation cellulaire, transmission synaptique, métabolisme énergétique 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 28

29 Validation par des approches classiques Protéine gamma Surexprimée dans la ZT des 6 patients analysés en ICPL Confirmation par western blot Patient 1 Patient 2 Patient 3 Patient 4 Patient 7 Patient 8 Patient 9 Patient 10 Patient 11 Patient 12 Patient 13 Patient 14 ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT ZI ZT ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT ZMN ZT Confirmation en immunohistochimie gamma (Abcam, ab69592) Patient 15 Patient 16 Patient 17 Patient 18 Patient 19 ZT ZMN 5% cellules tumorales neurones + oligodendrocytes 20% cellules neurones + tumorales oligodendrocytes 5% cellules tumorales neurones + oligodendrocytes 50% cellules neurones + tumorales astrocytes >80% cellules neurones + tumorales oligodendrocytes 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 29

30 Conclusions et perspectives Avantages de l ICPL : Quantification et identification en parallèle (ICPL vs DIGE) Marquage des protéines entières (sous-fractionnement, isoformes) Applications aux échantillons complexes Quantification relative par ICPL opérationnelle sur les spectromètres de masse MALDI-TOF-TOF (UltraFlex) et ESI-ITMS (HCT Ultra) Avantages de l ESI-ITMS pour l ICPL : compatibilité avec les analyses haut débit, dynamique des scans MS/MS Avantages du MALDI-TOF-TOF pour l ICPL : simplicité de l interprétation des spectres MS (espèces monochargées), précision des ratios H/L Quantification relative par ICPL duplex et triplex : utilisée en routine en ESI- ITMS Utilisation prochaine du MALDI-TOF-TOF pour l ICPL haut-débit grâce aux récentes avancées technologiques Analyses MALDI-TOF-TOF et ESI-ITMS en parallèle pour des identifications et quantifications plus poussées 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 30

31 Blandine Charoy Mélanie Lagarrigue-Reboutier Régis Lavigne Laëtitia Guillot Djibril Ousmanou Charles Pineau 6èmes Journées du Club-Jeunes de la SFEAP Grenoble, novembre 2010 Page 31