La Plateforme IdentyPath de l Anses : équipements, visite virtuelle, intérêts et objectifs:

Transcription

1 LES JOURNÉES STEAKEXPERT DU JUIN 2014 La Plateforme IdentyPath de l Anses : équipements, visite virtuelle, intérêts et objectifs: Patrick FACH Plateforme Nationale IdentyPath (Anses) Laboratoire de Sécurité des aliments de Maisons-Alfort 23 Av du général De Gaulle, Maisons-Alfort, France

2 Plate-forme IdentyPath: Moyens Humains et Techniques Historique : - COM AFSSA : Engagement de l Agence dans une démarche de transversalité et de mutualisation des compétences. Objectif de renforcer les synergies / la réactivité ---> PCP, PFT (Plates-formes Technologiques) Appel à projets 2010 du DIM «maladies infectieuses, parasitaires et nosocomiales émergentes» Conseil Régional d Île de France. ---> Soutien à la création d une jeune équipe labellisée

3 Plate-forme IdentyPath: Moyens Humains et Techniques Historique : - COM AFSSA : Engagement de l Agence dans une démarche de transversalité et de mutualisation des compétences. Objectif de renforcer les synergies / la réactivité ---> PCP, PFT (Plates-formes Technologiques) Appel à projets 2010 du DIM «maladies infectieuses, parasitaires et nosocomiales émergentes» Conseil Régional d Île de France. ---> Soutien à la création d une jeune équipe labellisée Moyens Humains et compétences : - DR1 (P. Fach) - CDI catégorie 2 (S. Delannoy, redéploiement interne en Juin 2010) - CDI catégorie 2 (C. Woudstra, passage CDD en CDI en Octobre 2013)

4 Plate-forme IdentyPath: Moyens Humains et Techniques Moyens Techniques : - BioMark (Fluidigm) ---> 100% Investissement DIM malinf - île de France - Light Cycler 1536 (Roche) ---> 100% Investissement Programme NRBC (CEA) - GeneDisc Cycler (Pall) ---> 100% Investissement AnibioThreat (DGJustice, CE)

5 Plate-forme IdentyPath: Moyens Humains et Techniques Moyens Techniques : - BioMark (Fluidigm) ---> 100% Investissement DIM malinf - île de France - Light Cycler 1536 (Roche) ---> 100% Investissement Programme NRBC (CEA) - GeneDisc Cycler (Pall) ---> 100% Investissement AnibioThreat (DGJustice, CE) Capacités Analytiques : - Détection de gènes (Recherche de marqueurs génétiques) - Expression de gènes - Génotypage SNP - Digital qpcr (Nouvelles approches de PCR quantitative)

6 qpcr très haut débit

7 Plateforme Nationale IdentyPath: BioMark (Fluidigm) : Financement DiM malinf

8

9

10

11

12 9 216 Réactions de qpcr

13 Les différents types de puces disponibles : 96 samples vs 96 genetic targets 48 samples vs 48 genetic targets 192 samples vs 24 genetic targets

14 BioMark _Fluidigm : Microfluidic and High throughput qpcr

15 BioMark _Fluidigm : Microfluidic and High throughput qpcr

16 BioMark: Utilisation de la chimie TaqMan

17 BioMark: Utilisation d agent intercalant Evagreen / Melting

18 BioMark TM Dynamic array : E. coli Strains comparison Groupe 1 Groupe 2

19 Plate-forme IdentyPath: un rôle majeur en Digital PCR 48 échantillons testés en Digital qpcr 770 chambre/échantillons réactions Coût analytique: ++++ / qpcr classique

20 Plate-forme IdentyPath: un rôle majeur en Digital PCR

21 Plate-forme IdentyPath: un rôle majeur en Digital PCR

22 Avantages de la technologie Dynamic Array qpcr classique puits 96 puits Master Mix : 240 µl 120 µl 46 ml 184 ml Primers / probe : 240 µl 120 µl 4.6 ml 18.4 ml Nb plaques : Temps : 3 heures 8 heures 8 jours 32 jours Pipetage : Rendement : Puce 96x96 : 9216 réactions Puce 48x48 : 2304 réactions Puce 24x192 : 4608 réactions Sensibilité / puces oligo. classiques Échantillons complexes Coût analytique: ++++ / qpcr classique

23

24

25 qpcr haut débit

26 Plateforme Nationale IdentyPath: Light Cycler 1536 (Roche) : Financement NRBC

27 Plateforme Nationale IdentyPath: Light Cycler 1536 (Roche) :

28 Plateforme Nationale IdentyPath: Bravo (Agilent) :

29 Validation Validation: 1 échantillon vs. 1 cible x 1536 Volume 2 µl (1 µl échantillon + 1 µl cible) Programme 96 échantillons x 16 cibles Chargement: 45 minutes Standard deviation Cp: 0.25 Volume 1.5 µl (0.5 µl échantillon + 1 µl cible) Programme 96 échantillons x 16 cibles Chargement: 45 minutes Standard deviation Cp: 0.24 Volume 1 µl (0.5µl échantillon + 0.5µl cible) Programme SNP Chargement: 12 minutes Standard deviation Cp: 0.21 Chargement pour la détection Chargement pour le génotypage

30 Light Cycler 1536 (Roche) : 2 - Sample Cible 1 Cible Mix Cible 3 Cible 4 Cible 5 Cible 6 Cible 7 Cible 8 - Absence de contamination -100% concordance de détection - Sensibilité détection - Reproductibilité intra-run 0.5 µl ADN + 1 µl mix 0.5 µl ADN µl mix

31 Light Cycler 1536 (Roche) : Specifications : - 2 channels (FAM) / (HEX) - Multiplexing - Melting curve analysis - Volume total 0.6-2µl - Fast Système

32 Light Cycler 1536: Utilisation de la chimie TaqMan

33 Light Cycler 1536: Analyses en courbe de fusion

34 Genotypage et identification de SNP MGB probes LNA probes

35 Flexibility in the design of the arrays

36 Flexibility in the design of the arrays Duplex PCR

37 Caractérisation génétique de E. coli O104:H4

38

39 qpcr moyen débit

40 Plateforme Nationale IdentyPath: GeneDisc Cycler (Pall) : Financement DG Justice, CE GeneDisc 6 secteurs Secteur central Echantillon ADN Puits de PCR Disques 6, 9 ou 12 secteurs Volume réactionnel 12 µl Capacité de multiplexage Simplicité d utilisation Intégration LIMS

41 Plateforme Nationale IdentyPath: GeneDisc Cycler (Pall) : Central Sector DNA sample PCR well GeneDisc 6 sectors Secteurs / puits: 6 secteurs : 6 samples tested against 12 targets. 9 sectors : 9 samples tested against 8 targets. 12 sectors : 12 samples tested against 6 targets Until 576 PCR determinations / 8 units

42 Detection of E. coli O104:H4 Development of a multi-parametric qpcr test targeting the genetic markers : stx2, rfb O104, flic H4, terd and aggr. IAC

43

44 qpcr petit débit

45 qpcr petit débit: Light Cycler nano - absolute/relative quantification - endpoint genotyping - melting curve analysis - high-resolution melting (HRM) Jusqu à 160 réactions PCR Concept de portable PCR

46

47 Plate-forme IdentyPath: un rôle majeur en Epidémiologie Moléculaire Séquençage Haut-Débit 1 Banques d ADN microbiens 2 Microarrays & PCR on Chips 3 Banque de marqueurs moléculaires Epidémio. moléculaire Ressources Biologiques (Anses) Plateforme Technologique IDPA (Anses) LNR, CNR, OMS, LR-UE (Réseau d épidémio surveillance)

48 IdentyPath, un rôle majeur dans le diagnostic moléculaire Du séquençage de génomes À la qpcr Haut débit À la mise en place de kit qpcr de détection À la sélection de marqueurs génétiques pertinents Multiplex PCR

49 Collaborations E. coli en cours University of Alberta Hospital Linda Chui Health Canada Alex Gill Hôpital Robert-Debré CNR associé E. coli Patricia Mariani-Kurkdjian SSI CC OMS E. coli Flemming Scheutz SVA Anna Aspan BfR LNR E. coli Lothar Beutin USDA James Bono USDA Pina Fratamico FDA Peter Feng VetAgroSup LNR E. coli Estelle Loukiadis ISS LRUE E. coli Stefano Morabito Texas Tech University Guy Loneragan CDC Nancy Strockbine Université de São Paulo Beatriz Guth CEA Thierry Livache INEI-ANLIS Marta Rivas CSIRO Robert Barlow

50 IdentyPath à votre service

51 Merci Anses, Laboratoire de Sécurité des Aliments plateforme IdentyPath 23 Av du général De Gaulle, Maisons-Alfort, France