Actualités sur le GAS et intérêt de l extemporané sur le GAS. Historique du GAS. Nouvelles recommandations pour
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- Amélie Beatrice Michel
- il y a 8 ans
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1 Actualités sur le GAS et intérêt de l extemporané sur le GAS Dr Cécile Bendavid Athias Centre Eugène Marquis Historique du GAS Avant : Curage axillaire systématique pour toutes les tumeurs infiltrantes du sein Le statut ganglionnaire était un facteur pronostic essentiel Complications trop élevées pour de nombreux curage négatif GAS pour les tumeurs unique, de petite taille(moins de 2 cm) Analyse histologique HEC et IHC Résultats selon taille de métastases : Macrométastases : > 2mm Micrométastases :,2< < ou =2mm CTI : <,2mm Résultats peu reproductibles et opérateur dépendant : relectures de lames pour études rétrospectives Nouvelles recommandations pour le GAS Taille tumorale jusqu à 5 cm Lésion unique Pas d antécédents de chirurgie homolatérale Avant chimiothérapie néoadjuvante Indications de curage axillaire (CA) si macrométastase, micrométastase(mi) ou cellules tumorales isolées (i+)
2 Pourtant..tendance àla désescalade thérapeutique Evolution des facteurs pronostiques : développement du profil moléculaire des cellules tumorales (luminal A, luminal B, Her2, basal like) et de leur profil histologique (RH; grade; index mitotique; Ki; Her2; embols) Place du ganglion dans le choix du traitement adjuvant systémique? Intérêt du CA devant une métastase occulte Récidive axillaire? Valeur pronostique des mi et i+ : Survie sans récidive et survie globale? Récidive axillaire Auteur Guenther Nb 46 Suivi Médian 32 Nb Rec Axill % Rec Axill ITC 23 Micro Méta 16 Macro Méta 7 Non précisé Fant Jeruss Naik ,4 Park Hwang Cox , Zakaria Meretoja Giuliano ,6 8 1,
3 Rôle des traitements adjuvants dans la récidive axillaire La plupart ont eu un traitement systémique Rôle de la radiothérapie externe sur le sein? Avenir de ce risque avec la radiothérapie partielle? Faut il réaliser un CA devant toute micrométastase(mi) ou i+? 4% de mi ou i+ (Rutgers EJ., Sentinel node biopsy: interpretation and management of patients with immunohistochemistry positive sentinel nodes and those with micrometastases. J Clin Oncol. 28 Feb 1;26(5):698 72). 12 à18% de GNS métastatiques retrouvés après CA pour mi ou i+ 12% pour I+ 18% pour mi Risque de méconnaitre une macrométastase sur GNS prélevé pour GAS I+ est inférieur au taux de FN de détection du GAS (1% contre à5%) Risque : méconnaitre atteinte GNS importante (4N+) qui modifierait la prise en charge adjuvante dont la radiothérapie ganglionnaire essai G. Houvenaegel Modèles prédictifs d atteinte des GNS: nomogramme ou score? MSKCC nomogram MDA score Degnim nomogram Tenon score Stanford MLR Micro métastase nomogram Taille de la tumeur Grade Emboles Nombre de GS prélevés Nombre de GS+ Atteinte GS : macro/micro Méthode de détection GS+ Type histologique RO Multifocalité Atteinte GS extra capsulaire * * * ratio
4 Inconvénients de ces modèles Intègrent àla fois macro, micro et i+ Fiables pour les macrométastases mais peu pour les micrométastases en IHC Effectifs insuffisants Validation par groupe de patientes Valeur pronostique des i+ Pas de différence en terme de SSR et SG par rapport au N Maibenco DC, Dombi GW, Kau TY, Severson RK. Significance of micrometastases on the survival of women with T1 breast cancer. Cancer. 26 Sep 15;17(6): Giuliano AE, Hunt KK, Ballman KV, Beitsch PD, Whitworth PW, Blumencranz PW, Leitch AM, Saha S, McCall LM, Morrow M.Anderson. Axillary dissection vs no axillary dissection in women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: a randomized clinical trial. JAMA. 211 Feb 9;35(6): Weaver DL, Ashikaga T, Krag DN, Skelly JM, Anderson SJ, Harlow SP, Julian TB, Mamounas EP, Wolmark N. Effect of occult metastases on survival in node negative breast cancer. N Engl J Med. 211 Feb 3;364(5): Epub 211 Jan 19. Schmidt C. What to do about occult metastases in breast cancer? Standards shift, but doubts linger. J Natl Cancer Inst. 211 May 18;13(1): Epub 211 May 6. Andersson Y, Frisell J, Sylvan M, de Boniface J, Bergkvist L. Breast cancer survival in relation to the metastatic tumor burden in axillary lymph nodes. J Clin Oncol. 21 Jun 1;28(17): Epub 21 May 1. Valeur pronostique des micrométastases : Plus discutable Mêmes études montrent une différence significative avec N Mais faible (p=,3) (Weaver DL, Ashikaga T, Krag DN, Skelly JM, Anderson SJ, Harlow SP, Julian TB, Mamounas EP, Wolmark N. Effect of occult metastases on survival in node negative breast cancer. N Engl J Med. 211 Feb 3;364(5): Epub 211 Jan 19). intérêt d étude prospective sur des groupe de population, entre autre les populations à faible risque moléculaire et histologique de la lésion tumorale nord américain : pas de récidive axillaire, différence en terme de SSR et SG trop faiblement significative par rapport au coût
5 Au total Les remises en questions ne portent probablement pas sur les tumeurs de type basal like et les luminal B mais sur les petites tumeurs luminal A A ce jour : indications de CA quelle que soit la taille de la métastase ganglionnaire Impression que l attitude va évoluer vers un désescalade thérapeutique mais nécessité de nouvelles études, prospectives, sur des groupes de populations (luminal A?), effectifs importants et PRUDENCE Dans tous les cas, la micrométastase semblerait avoir une valeur prédictive sur la SSR et SG, donc guiderait dans la prise en charge adjuvante; GAS garde toute sa place Place de l extemporané Intérêt mise en évidence des macrométastases Intérêt mise en évidence des mi aujourd hui selon les recommandations Bénéfice pour la patiente : Évite reprise chirurgicale Annonce dès le soir de l intervention Délai de mise en route des traitements adjuvants plus court Intérêt OSNA Résultat fiable et définitif en peropératoire Examen reproductible, non opérateur dépendant Quantification possible de l atteinte métastatique ganglionnaire en nombre de copies
6 Objectif du Club Utilisateur OSNA Mieux définir les cut off en fonction : des critères cliniques de la patiente : statut ganglionnaire axillaire non sentinelle De la carte moléculaire tumorale Créer des nomogrammes propre àla technique OSNA de façon àsuivre l évolution des prises en charges OSNA (Sysmex( Sysmex) Analyse par biologie moléculaire des ganglions sentinelles dans la chirurgie des cancers du sein Dr Florence Godey Département de Biologie Centre Eugène Marquis 27 mai 211, La Baule 17 Comparaison de l approche conventionnelle et de la méthode OSNA Approche conventionnelle Examen extemporané coupe congelée / empreinte: (si réalisée) Faible sensibilité ( biais d échantillonnage) Analyse définitive Coupe en paraffine: H&E + IHC Seul 5% du ganglion est analysé (dépendant de la méthode utilisée) Pas de standardisation Reprise chirurgicale si Faux négatif en extemporané Méthode OSNA Analyse peropératoire du ganglion entier Haute sensibilité (pas de biais d échantillonnage) Pas d analyse postopératoire nécessaire Possibilité de conserver une partie du tissu pour analyse histologique conventionelle Une seule chirurgie (biopsie sentinelle + curage axillaire) 18
7 OSNA = One Step Nucleic Acid Amplification Automate/réactifs Le RD-1i : analyseur qui amplifie les ARNm CK19 selon la méthode RT-LAMP (Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification) OSNA permet de statuer sur la présence ou l absence de métastases dans le ganglion sentinelle en 3 minutes 19 Marqueur = Cytokeratine 19 (CK19) Spécifique des cellules épithéliales normalement non présentes dans les ganglions lymphatiques Niveau d expression élevé dans les cellules tumorales mammaires Donc des niveaux d expression différents dans les ganglions envahis ou non. 2 Les marqueurs doivent avoir un niveau d expression très différent dans les échantillons +/ mrna expression ratio between HE(+) and HE (-) sample mrna expression level in HE(+) sample CEA 1.E+4 CK19 1.E+3 MUC1 MGB1 1.E+2 1.E+1 1.E+ CK18 CK2 Taux d expression relatif pos/neg ß-actin Molecular ID Taux d expression dans les ganglions positifs CEA CK19 CK2 ß-actin 1.E+8 MUC1 CK18 1.E+7 1.E+6 1.E+5 1.E+4 MGB1 1.E+3 1.E+2 1.E+1 1.E Molecular ID 21
8 Procédure OSNA GS Homogenisation Centrifugation Amplification 5 min 1 min 16 min; 65 C Pour 1 analyse deux réactions d amplification sur échantillon pur et dilué (1/1) 4 amplifications en simultané + 1 contrôle positif + 1 contrôle négatif 22 Amplification ARNm CK19 par RT LAMP (Reverse Transcription Loop mediated Isothermal Amplification) Haute spécificité et sensibilité Utilisation de 6 amorces Pas d amplification d ADN génomique Amplification rapide (16 min) Pas d extraction d ARNm Réaction isothermique à 65 C (pas besoin de thermocycleur) Amplification totalement automatisée RD1i 23 Détection OSNA Le temps d'élévation correspond à l'instant auquel la réaction d'amplification de l ARNmCK19 progresse rapidement et la turbidité générée par l'amplification dans l'échantillon atteint un seuil prédéfini. Un temps d'élévation court traduit une forte concentration de l ARNmCK19 Détection du pyrophosphate Détermination du Temps d élévation Détermination de la quantité d ARN Pyrophosphate de magnésium Libération de phosphate lors de l intégration des nucléotides: réaction avec le magnésium pyrophosphate de magnésium qui trouble le milieu 24
9 Suivi en temps réel La concentration de l ARNm CK19 est calculée selon la courbe d'étalonnage générée par la détermination du temps d'élévation d'un jeu de troiscalibrantsde concentration connue en ARNm CK Le nombre de cellules cancéreuses est corrélé au nombre de copies d ARNm de CK19 Cancer cell number CK19 mrna 6 8 cancer cell number/section 7 5 CK19 copy number/section Section No. CK19 mrna (copy number/section) 26 Définition du niveau seuil OSNA Taille de la métastase ARNm CK19 Macrométastase Micrométastase ITC // bruit de fond copies/ µl + 25 copies/ µl* - *Calcul du niveau seuil : 1 cellule épitheliale = taille de 1 2 µm = ~ 1. copies CK19 mrna Foyer tumoral de,2 mm³ (micrométastase) = ~ 8. cellules = ~ 8.. copies ~ 5. cellules (OSNA cut off) = 5.. copies (dilution 1:2. 25 copies /µl) 27
10 Interprétation des résultats OSNA Nombre de copies ARNm CK19/µl Résultats RD 1i Sysmex Interprétation du résultat pur 25 et <5 (+) Micrométastase pur 5 (++) Macrométastase Dilution 25 Pur <25 (+) i Métastase non quantifiée Etudes de validation OSNA Sur coupes alternées de ganglions: analyse histologique versus analyse moléculaire Résultats poolés des études de concordance japonaises, allemandes, hollandaises, anglaises et française sur plus de 2 GS concordance à 96,5% après analyse de discordance, sensibilité 95,6% et spécificité 96,% Procédure pour l analyse des GAS avec méthode OSNA Les GAS sont immédiatement préparés pour l analyse moléculaire par le chirurgien et transmis au technicien du laboratoire qui se déplace au bloc opératoire Les GAS sont transportés sur glace jusqu au laboratoire (3mn) Le technicien broie les ganglions et prépare le lysat pour l analyse moléculaire au laboratoire (5mn/GAS) analyse la totalité de chaque GAS L amplification moléculaire est réalisée sur le lysat (16mn+2mn par GAS) Le technicien ou biologiste communique par téléphone le résultat au chirurgien L automate pour l analyse moléculaire doit être calibré avant le début du programme opératoire: décongélation des réactifs (3mn) calibration de l automate (2mn)
11 Résultats OSNA GAS OSNA au CEM: actuellement plus de 6 patientes Analyse statistique (SAS statistical analysis System) 367 procédures GAS OSNA Temps d analyse OSNA Résultats GAS OSNA en fonction facteurs pronostiques classiques taille tumorale Grade SBR Ki67 RH statut HER2 Résultats GAS OSNA et analyse des ganglions de curage axillaire Résultats GAS OSNA et GAS selon méthode de référence (cohorte historique 355 patientes) Nombre d analyses OSNA Temps de réalisation 81 GAS (91 analyses) 2,219 GAS/patients (2,468 analyses/patients) Temps d analyse Pour 1 GAS 32,9mn (n=88) Pour 2 GAS 36,4mn (n=132) Pour 3 GAS 41,6mn (n=81) Pour 4 GAS 48,5mn (n=34) Patientes OSNA total OSNA Historical Cohort Restricted Cohort Cohort Number of patients Medium age of patients 56.8 years Tumour histology Ductal invasive carcinoma Lobular invasive carcinoma In situ carcinoma 43 Other 16 Tumour size 1a b c Missing values 44 SBR Grade Missing values 34 Hormones receptor status Estrogen/progesterone + 3 Estrogen/progesterone - 51 HER Triple Negative 29
12 GAS + OSNA Facteurs pronostiques habituels Augmentation significative GAS+: N % patients SLN + OSNA P value -taille tumorale (14% T1a; 48% T2) Age < > NS -Ki67 (25,2% Ki67<2 ; 39,3% Ki67>2) -HER2+ (26,2% HER2-; 47,6% HER2+) Size of primary tumour T1a T1b T1c T2 Hormone receptor Status Estrogen/progesterone+ Estrogen/progesterone ,9 NS Bloom-Richardson grade NS Ki67 < 2% Ki67 >2% HER2 + HER Triple negative Yes No NS GAS + : quel est le % de ganglions de curage métastatiques % ganglions non sentinelles envahis dépend de la taille de la métastase dans le GAS : -33 à 4% si macrométastase -11 à 17% si micrométastase % of patients SLN+ OSNA OSNA result patient SLN+ % Patients with lymph node metastasis in ALND Correlation between lymph node metastasis in ALND and SLN+ OSNA Ductal invasive carcinoma 27.8% (69/248) 3 Macrometastasis 26 Micrometastasis 13 Metastasis with inhibition 33,3% (1/3) 11,5% (3/26) 7,6% (1/13) P<.1 P=.129 NS Lobular invasive carcinoma 3.% (18/6) 1 Macrometastasis 6 Micrometastasis 2 Metastasis with inhibition 4% (4/1) 16,6% (1/6) (/2) P=.2 % GAS métastatiques (Tumeurs <2cm) OSNA versus Histologie 24,2% GAS+ avec OSNA 24,8% GAS+ avec histologie conventionnelle (avec Cellules tumorales isolées) 22,8% GAS+ avec histologique conventionnelle (sans Cellules tumorales isolées) Pas de différence significative lobular invasive breast tumour 21,8 28,5 23,81 T1c 29,5 28,5 26,6 OSNA Cohort Ductal invasive breast tumour 25 24,3 22,7 T1b 17,7 21,6 19,2 historical Cohort including ITC Historical Cohort Invasive breast tumour 24,2 24,8 22,8 T1a 15,
13 La technique OSNA Le débat actuel: comment faut il traiter les patientes avec GAS métastatique? Controverse actuelle repose sur plusieurs publications: l analyse des GAS est histologique plus au moins intensive pas toujours bien décrite ni standardisée. pas d analyses exhaustives des GAS (impossibles car trop coûteuses si l on doit réaliser des coupes fines et une analyse imunohistochimique) les mêmes auteurs (D. Weawer) qui débattent de l intérêt de rechercher une métastase occulte, avaient au préalable largement discuté la difficulté de trouver une méthode standardisée et fiable pour mieux comprendre la signification des micrométastases. OSNA Possibilité d analyser de manièrefiableet standardisée la totalité du ganglion sentinelle en peropératoire nombre copies ARNm CK19 reflète la totalité du volume tumoral dans le GAS: sortir du concept macrométastases, micrométastases, cellules tumorales isolées Prendre en compte le nombre de copies d ARNm CK19 détectées dans les GAS, les caractéristiques tumorales, les contraintes opératoires pour choisir la meilleure stratégie thérapeutique pour la prise en charges des patientes opportunité qu il faut évaluer (nomogrammes) 37 Conclusion OSNA: technique fiable et standardisée permettant l analyse de tout le ganglion OSNA pas seulement une analyse extemporanée: fait aussi bien que l analyse histologique définitive, l extemporanée +++ avec les nouvelles recommandations tumeurs <5cm OSNA a sa place dans le débat actuel : pour faire les curages axillaires et/ou les traitements adjuvants àbon escient Implication importante de tout le personnel médical et paramédical pour la mise en place de la technique OSNA Remerciements : aux Dr C.Bendavid Athias, Dr S. Rouquette, Dr F. Foucher, Pr J. Levêque, Dr J. Blanchot, Dr J. Vialard, Dr V.Quillien, Dr G.Gandon, Dr P. Tas, Dr O. Coué, Dr. N.Heresbach, À l équipe du bloc opératoire, aux techniciens de l analyse moléculaire, M. Marty, S. Moiteaux, G. Duval
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