Les microbes Microbiologie médicale

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1 Les microbes Microbiologie médicale Professeur Guillaume Arlet Hôpital Tenon, AP-HP Faculté de Médecine, UPMC Cours IFSI 2010 Semestre 1

2 Définition»Micro-organismes Etres vivants microcopiques Uniquement visible qu au microscope Premiers êtres vivants sur terre Environ 3 à 4 miliards d années

3 Evolution en millions d année Archaebactéries Cellule eucaryote 9 E. coli 0,03

4 Classification des microbes Etres unicellulaires : protistes La division cellulaire génère deux individus Protistes eucaryotes (vrai noyau) Protozoaire Algues Champignons et levures Protistes procaryotes Bactéries Acaryotes : virus

5 LES BACTERIES Définition Etre vivant, unicellulaire, de petite taille (généralement 1 micro de diamètre et quelques microns de longueur). Cellule procaryote donc dépourvue d un véritable noyau : absence de membrane nucléaire, chromosome unique en général. Paroi rigide faite d un constituant spécifique : peptidoglycane ou mureine. Classification est fondée sur les caractères morphologiques, tinctoriaux, biochimiques, antigéniques génétiques

6 Structure générale Flagelles Pili sexuel Membrane cytoplasmique Paroi Capsule Pili communs Chromosome Ribosomes

7 Rôle du peptidoglycane Propriétés du Peptidoglycane forme et rigidité de la bactérie affinité tinctoriale selon l épaisseur : coloration de Gram sensibilité au lysozyme, aux antibiotiques

8 Bactérie à Gram positif Bactérie à Gram négatif Acides téchoiques Membrane externe Porine LPS peptidoglycane espace périplasmique Membrane cytoplasmique

9 Autres composants de la paroi bactérienne Membrane externe (Gram -) : lipopolysaccharide (LPS), endotoxine, antigène somatique O Membrane interne (Gram -) ou cytoplasmique (Gram +) : barrière osmotique métabolisme énergétique. Capsule (inconstante) : polysaccharidique, virulence, (opsonisation): S. pneumoniae

10 Appendices externes Flagelles : 15 à 20µ de long Mobilité Protéine antigénique : antigène H Implantation Polaire Péritriche Monotriche Lophotriche Pili. : 0,2 à 5 µ de long Structure et fonctions : poils raides, en protéine, sexuels (transfert génétique), communs (adhésion) : Escherichia Cours IFSI 2010 coli, S1 Pr Neisseria G. Arlet gonorrheae

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12 Spore : chez bacilles à gram positif, Bacillus, Clostridium Formation : sporulation (intracytoplasmique) sécheresse, chaleur, appauvrissement du milieu formation de la préspore, maturation, germination Fonction Conservation du patrimoine génétique résistance aux agents physiques et chimiques. Température, chaleur (100 C), UV, Rayons X, agents chimiques Stérilisation : Chaleur humide à 120 C

13 LES CONSTITUANTS INTERNES Cytoplasme Acide désoxyribonucléique : Chromosome, ADN surenroulé Plasmide Réplication sur les deux brins (< 20 min.) Acides ribonucléiques : messager, de transfert, Ribosomal Small ARN

14 Morphologie quelques exemples Coques Gram + en amas Bacilles gram mobiles péritriches Coques Gram + en chainettes Diplocoques Gram + capsulés Bacilles Gram - capsulés Bacille Gram mobile polaire Vibrions, Campylobacter Bacilles Gram + sporulés Spirilles Tréponème

15 LA CROISSANCE Conditions physicochimiques - Température bactéries mésophiles - optimum de 20 C à 40 C. certaines bactéries (psychrophiles) cultivent mieux à 4 C. bactéries thermophiles -ph en général optimum de croissance à la neutralité -Pression osmotique saumure (NaCl > 30 %) empêche la croissance

16 LA CROISSANCE - Pression partielle d 0 2type respiratoire : Aéro Anaerobie Aérobie Microaérophile Anaérobie

17 LA CROISSANCE Quelques exemples de temps de génération Escherichia coli : 17 minutes Staphylococcus aureus : 30 minutes Lactobacillus acidophilus : 75 minutes Mycobacterium tuberculosis : 20 heures Treponema pallidum : 33 heures

18 Génétique : Les outils de l évolution bactérienne Mutation Acquisition d ADN étranger Transformation Transduction Conjugaison Transposons conjugatifs Remodelage interne Séquences d insertion transposons

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20 CARACTERES DES MUTATIONS 1/ Rareté : 1 individu sur / Spontanéité La bactérie mutante pré-existe au sein de la population avant même tout contact avec l agent sélectif 3/ Discontinuité La modification s effectue en une seule étape selon la loi du tout ou rien, 4/ Stabilité et transmissible à la descendance.

21 Plasmides Gènes de résistance Gènes de virulence

22 CONJUGAISON

23 Flores bactériennes humaines Pr. Guillaume ARLET UFR de Médecine Université Pierre et Marie Curie

24 Homme et bactéries quelques notions Homme : cellules eucaryotes et bactéries Nouveaux nés : stériles à la naissance

25 Flore humaine quelques définitions Flore commensale (cum mensa) Flore saprophyte Flore transitoire Notion de virulence Bactérie pathogène stricte Bactérie pathogène opportuniste

26 Les flores humaines Flores humaines peau : /cm 2 rhinopharynx 10 8 /ml oropharynx : 10 8 /ml digestive : /g vagin : 10 8 /ml

27 Le corps humain Les régions stériles trachée, bronches, poumons sous la peau les urines séreuses et organes

28 Flore bactérienne cutanée La peau est située en première ligne dans la défense visà-vis des infections. La flore cutanée normale a un rôle de protection contre les infections par plusieurs mécanismes : l interférence bactérienne, la production d acides gras, et même par la production de peptides antimicrobiens. Plus de 200 espèces bactériennes identifiées

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30 Variation quantitative de la flore cutanée Régions sébacées : /cm 2 De part et d autre des narines, Régions pileuses Conduit auditif externe Régions humides : /cm 2 Aisselles Périnée Espaces interdigitaux Nombril Régions sèches : 10 2 /cm 2

31 Flore aérienne supérieure Rhinopharynx Oropharynx Staphylocoque doré (orifices narinaires en particulier) Streptocoques, dont S. pneumoniae Haemophilus, donth.influenzae Neisseria (éventuellement Neisseria meningitidis dont le portage est transitoire) Anaérobies, corynébactéries, lactobacilles.

32 Flore digestive humaine

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34 Flore digestive humaine : rôle 1. Commensalité Participation à la digestion alimentaire Synthèse de vitamines (K, folates, B) 2. Résistance à l infection Effet de barrière Bactériocines Encombrement stérique Métabolites toxiques Déplétion alimentaire

35 Effet de barrière

36 Flore vaginale Les lactobacilles acidophiles (bacilles de Döderlein), par leur sécrétion d'acide lactique entretiennent un ph bas qui limite la flore de colonisation et permet la fécondation). Streptocoque (Streptocoque B essentiellement) Corynébactéries Bifidobacterium. Après la ménopause, les anaérobies et entérobactéries sont plus abondantes.

37 Flore bactérienne et antibiotiques Flore commensale habituellement sensible Flore soumise à pression de sélection Émergence de la résistance Transfert de la résistance Transformation (acquisition d ADN nu) Conjugaison (acquisition de plasmides R)

38 Flore bactérienne et système immunitaire Système immunitaire et flore digestive La flore digestive permet le développement du système immunitaire digestif et sa stimulation permanente

39 Conflit hôte-bactérie notion de virulence Apport constant de bactéries extérieures Pas d implantation dans la très grande majorité des cas Rarement maladies infectieuses Origine commensale parfois

40 Bactéries pathogènes la tenue de combat Pili sexuels Pili communs Peptidoglycane Flagelles internalines sidérophores cytotoxines LPS capsule

41 Bactéries pathogènes : la tenue de combat

42 Conflit hôte-bactéries critères de virulence Propriétés Bactéries virulentes Infection Bactéries opportunistes Hôte Immunocompétent Immunodéprimé Rupture des barrières Dose infectante faible forte Pathogénicité forte faible Persistance oui non

43 Conflit hôte-bactérie Bactéries virulentes/doses infectantes Bactérie Maladie Dose infectante Voie de pénétration Salmonella typhi Fièvre typhoïde 10 5 orale Shigella dysenteriae Mycobacterium tuberculosis Dysenterie bacillaire 10 orale Tuberculose 1-10 respiratoire Yersinia pestis Peste 1-10 piqûre Rickettsia prowazeki Typhus 1-10 piqûre

44 Pouvoir pathogène bactérien Pénétration dans l organisme Multiplication locale Expression de la pathogenicité Diffusion dans l organisme Résistance au système immunitaire Persistance dans l organisme

45 Expression du pouvoir pathogène Bactéries «toxiques» «invasives» pénétration Oui Oui multiplication locale toxines +++ +/- diffusion Non +++ tableau intoxination infection diffuse traitement symptomatique antibiotique

46 Les outils de la virulence Implantation : adhésines, pili Production de toxines très puissantes Pénétration intracellulaire : internalines Destruction tissulaire enzymes : cytotoxines Résistance à la phagocytose et au complément : capsule et lipopolysaccharide Captation du fer : sidérophores Survie intracellulaire

47 Les pathogènes opportunistes Pathogènes car diminution des défenses «Immunodépréssion» Maladies du sang, cancer, etc Age : NN et personnes agées Terrain : diabète, alcoolisme, insuffisant respiratoire Iatrogène : sondage, KT, réanimation Médicaments : corticoides, AINS

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49 Le Choléra l agent pathogène Vibrio cholerae Bacille à Gram - halophile très mobile vit dans les eaux alcalines salées Épidémies Circonstances de survenue

50 Le Choléra le tableau clinique Diarrhées profuses Selles «eaux de riz» très liquides Déshydratation Décès Traitement par réhydratation

51 Le Choléra la physiopathologie NaCl Cl - HCO 3 - Protéine G kinase AMPc ATP Adénylate cyclase

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53 Le Tétanos Quel est mon nom? : Clostridium tetani Qui suis je? : Un bacille gram + anaérobie D ou viens-je? : le cheval est mon ami Pourquoi je résiste? : je sporule Que fais-je? : je donne le Tétanos

54 Le Tétanos Plaie cutanée Germination Multiplication locale Elaboration de la toxine Blocage de la transmission des neurotransmetteurs Paralysie et asphyxie

55 Les Salmonelles Adhésion aux cellules jéjuno-iléales Invasion par invasine qui reconnaissent les intégrines des cellules Réarrangement du cytosquelette Persistance, survie et multiplication dans le phagosome

56 Les Shigelles Pénétration par les cellules M Invasion par le complexe IpaB-IpaC secrété par un système de sécrétion de type 3 Ipa (invasion plasmid antigen) Lyse des phagosomes Apoptose des macrophages Pénétration des autres cellules épithéliales

57 Les Shigelles Cellule épithéliale Cellule M apoptose Caspase 1 IL-1ßactivé Polynucléaire Cours IFSI 2010 S1 Macrophage Pr G. Arlet

58 Les pathogènes opportunistes Pathogènes car diminution des défenses «Immunodépréssion» Maladies du sang, cancer, etc Age : NN et personnes agées Terrain : diabète, alcoolisme, insuffisant respiratoire Iatrogène : sondage, KT, réanimation Médicaments : corticoides, AINS

59 Staphylococcus aureus Portage nasal chez 10 à 40% des individus 10 3 à 10 4 / cm 2 60% des individus sont porteurs de manière intermittente Durée du portage de plusieurs mois à plusieurs années Autres sites :vagin, périnée, peau, plaies

60 Staphylococcus aureus S. aureus expriment de nombreux facteurs de virulence 1ère étape colonisation de la peau et des muqueuses rôle des acides lipoteichoïques Pénétration par effraction ou brûlure Colonisation des tissus sous jacents Résistance à la phagocytose Élaboration de toxines

61 Staphylococcus aureus Multiplication et Dissémination Sidérophores en phase post exponentielle de croissance Coagulase qui se lie à la prothrombine qui se transforme en thrombine activée qui transforme le fibrinogène en fibrine Staphylokinase qui fragmente le caillot en envoie des micro-embols septiques dans la circulation

62 Staphylococcus aureus

63 Escherichia coli E. coli responsables d infections intestinales ETEC E. coli enterotoxinogènes Epidémies enfants pays EVD, diarrhées du voyageur (turista) EPEC E. coli entéropathogènes pays EVD Diarrhées aigueset chroniques dans les écoles et les crèches EIEC E. coli entéroinvasifs Syndromes dysentériques EHEC E. coli entérohémmoragiques Colites hémmorragiques et SHU EAggEC E. coli entéroaggrégatifs Diarrhées chez nourrissons et enfants pays EVD DAEC E. coli Adhésion diffuse

64 Escherichia coli infections extraintestinales Infections urinaires, pyélonéphrites Méningites néonatales Cholécystites Septicémies Infections suppuratives diverses ExPEC

65 Escherichia coli ExPEC : Adhésion par FimH P fimbriae (opéron pap), S fimbriae Adhésine non fimbriale (Afa) Capsule K1 : résistance à la phagocytose Cytotoxines Hémolysines A (opéron à 4 gènes) Toxine dermonécrotique CNF 1 Sidérophores aérobactine, yersiniabactine Recepteurs de ces sidérophores (IutA, FyuA)

66 Transmission des bactéries Réservoirs Modalités de transmission Directe Indirecte Les infections liées aux soins

67 Réservoirs - Strictement humain selon la matière infectante * selles (fièvre typhoïde, diarrhées) * sécrétions génitales (maladie vénérienne, IST) * chancre (maladie vénérienne, IST) * air expulsé (méningococcie, charbon, tuberculose) * accouchement (fièvre puerpérale) -animal * salive (pasteurellose) * délivrance * lait * carcasses (ganglions) - autres * eau (choléra...) * aliment (TIAC, Listeria...) * ectoparasites (maladies vectorielles)

68 Transmission - Voies de contamination. directe * homme à homme - gouttelettes : méningocoque, bacille tuberculeux - main (dysenterie bacillaire, S. aureus, ILS) - contact vénérien - mère à enfant (transmission verticale) * animal à homme - morsure, griffade, léchage - contact direct (maladie professionelle) * ectoparasites - morsure de tiques (borréliose de Lyme) - puces, poux.... indirecte * eau, aliments (Brucella, Salmonella, Listeria...) * air (Coxiella burnetii...) * autres (étables...)

69 Fièvre Q spore? Résistance Syndrome pseudo-grippal + pneumonie atypique Réservoirs animaux Bactérie intracellulaire obligatoire Coxiella burnetii Variant résistant (spore?) Petites épidémies Transmission aérienne Année Source Nb. cas Principaux signes cliniques 2002 ovine 99 Fièvre, céphalées, TRA* 2000 fumier (chèvre) 10 Fièvre, céphalées, myalgies 2001 fumier (ovin) 5 Fièvre, céphalées, TRA 1996 ovine 29 Fièvre, céphalées, TRA ovine 289 Fièvre, céphalées, TRA * TRA, augmentation des transaminases

70 La transmission manuportée Cause de transmission des ILS Malades fragiles Malades en réanimation Transmission en ville Transmission des BMR

71 Antibiotiques Modes d action Mécanismes de résistance

72 Définition Agents antibactériens naturels ou obtenus par synthèse ou par semi-synthèse présentant une activité : liée à un mécanisme d action spécifique exercée à de faibles concentrations sur certaines espèces bactériennes (spectre d activité large ou limite) relativement lente bactériostatique ou bactéricide une toxicité sélectivement dirigée contre les bactéries

73 CLASSIFICATION : Par famille et la structure chimique de base ß-lactamines, aminosides, quinolones Par le spectre Gram +/- Anti-pseudomonas Par mécanismes d action Paroi Acides nucleiques Synthèse protéique

74 Antibiotiques et Bactéries ß-lactamines Aminosides Fluoroquinolones Tetracyclines Trimethoprime & sulfamides Chloramphenicol Rifampicine fosfomycine Gram - Gram + Macrolides Glycopeptides

75 Cibles potentielles des antibiotiques Porines Peptidoglycane Membrane cytoplasmique Pompes efflux PLP Membrane externe Peptidoglycane ADN ARN Ribosomes Protéines

76 MECANISMES D'ACTION DES ATB - CIBLES Mécanisme d'action Familles d'atb Inhibiteurs de la synthèse de la paroi bactérienne (PG) Inhibiteurs de la synthèse des protéines β-lactamines (PBP) Glycopeptides (D-Ala-D-Ala) Fosfomycine (précurseurs) Aminosides Tétracyclines Chloramphénicol Macrolides Inhibiteurs de la synthèse des AN ou du fonctionnement de l ADN synthèse des précurseurs réplication de l'adn inhibition de l'arn polymérase Sulfamides Quinolones Rifampicine

77 Résistance acquise de souche Une bactérie est dite résistante par événement génétique acquis lorsqu elle peut croître en présence de concentration d antibiotique plus élevée que la concentration qui inhibe les souches normales de l espèce Population «normale» Population R

78 SUPPORT GENETIQUE DE LA RESISTANCE ACQUISE CHROMOSOMIQUE Mutation Spontanée, rare, stable, Spécifique de l ATB ou d une famille PLASMIDIQUE ou TRANSPOSABLE +/- stable Transmission Transmission verticale verticale horizontale même espèce ou espèces différentes Dissémination de la R Dissémination de la R = descendance = épidémies de souches = épidémies de souches de plasmides, de gènes

79 MECANISMES DE RESISTANCE ACQUISE AUX ANTIBIOTIQUES Modification de la cible Défaut de liaison entre ATB et cible = AFFINITÉ Inactivation de l ATB = SYSTÈME ENZYMATIQUE Nouvelle voie de synthèse : by pass Efflux actif = EXCRÉTION Défaut de pénétration de l ATB = IMPERMÉABILITÉ

80 SARM AP-HP

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82 Enterocoque et R glycopeptides ERV Colonisation plutôt qu infection Épidémie souterraine dans les hôpitaux

83 R C3G chez E. coli Prevalence of resistance to extended-spectrum cephalosporins among E. coli isolates from bacteraemias (European Antimicrobial Resistance Surveillance System)

84 Carbapénémases Pip Tic Amx Tz Fox Cf Ma Ctx Amc Caz Atm Fep Tcc Imp Mox Classe A : KPC New-York, Grece, Israel K. pneumoniae (50%), E. cloacae, E. coli Cas d importation : Paris Classe B (MBL) : VIM, (IMP), (NDM) Italie, Grèce, Tunisie K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa Cas d importation : Paris Classe D : OXA-48; OXA-23/-58/- 40

85 Mise en évidence des bactéries Pr Guillaume Arlet Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie, UPMC Hôpital Tenon, AP-HP

86 Rôle du laboratoire de Bactériologie médicale Caractérisation de la bactérie responsable du syndrome infectieux Méningites Pneumonies Infections urinaires Angines Septicémies Infections gynécologiques Cholécystite

87 Origine bactérienne du sepsis? Infections virales : angine, syndrome grippal, méningites Infections parasitaires : Diarrhées sanglantes Paludisme

88 Infections bactériennes et syndrome inflammatoire Bactéries: réaction macrophages et polynucléaires (pus) Virus réaction macrophage et lymphocytes Parasites réaction à P. oesinophiles Pb des bactéries intracellulaires : réaction lymphocytaire

89 Les grandes étapes de l identification bactérienne Examen direct au microcope : 1 heure Cytologie, coloration de Gram, morphologie Culture : 24 heures Identification : heures Etude de la sensibilité aux antibiotiques : heures

90 Un bon prélèvement Méningites: LCR par ponction lombaire Pneumonies : ECBC, Aspiration bronchique Infections urinaires : ECBU Sepsis grave : hémocultures Cholécystite : prélèvement opératoire Angine : écouvillonage pharyngé

91 Un bon prélèvement Stérilité : ECBU, LCR, Sang Problèmes des flores normales humaines ORL Digestive Gynécologique Cutanée Problème des bactéries fragiles et anaérobies

92 Quelques prélèvements

93 Rappel sur la paroi bactérienne Bactérie à Gram positif Acides téchoiques Membrane externe Bactérie à Gram négatif Porine LPS peptidoglycane espace périplasmique Membrane Cours IFSI 2010 cytoplasmique S1 Pr G. Arlet

94 Morphologie quelques exemples Coques Gram + en amas Bacilles gram mobiles péritriches Coques Gram + en chainettes Bacilles Gram - capsulés Diplocoques Gram + capsulés Vibrions, Campylobacter Bacille Gram mobile polaire Bacilles Gram + sporulés Spirilles Tréponème

95 ECBU à Escherichia coli

96 Hémoculture à Campylobacter

97 Méningite à méningocoque

98 Endocardite à Streptocoque

99 Culture Différents milieux Standard Enrichis (sang frais, sang cuit) Sélectif Température 37, 30, 44 Atmosphère : normale, CO2, anaérobie

100 Les modalités de l isolement

101 Un isolement parfait

102 Isolements sélectifs Gélose de Chapman pour S. aureus Gélose de Drigalski pour entérobactéries

103 Milieux enrichis Gélose au sang frais Gelose Chocolat

104 Identification bactérienne Méthodes biochimiques Mise en évidence de métabolites Fermentation des sucres Méthodes antigéniques Mise en évidence d antigènes de surface Méthodes moléculaires PCR

105 Identification biochimique

106 Identification antigénique

107 Antibiogramme 0, ,25 0, ,25 J0 J+1 0, ,25 0, ,25

108 Antibiogramme BMR AMX TIC TZP PIP CF MA CXM FOX FEP AMC TCC CTX MOX CAZ ATM IPM

109 Apport de la biologie moléculaire à la bactériologie médicale Identification bactérienne Mise en évidence de gènes de virulence Mise en évidence de gènes de résistance Épidémiologie moléculaire

110 Les grands problèmes actuels Pays très pauvres Choléra, Tuberculose, Lèpre Diarrhées, Pneumonies Pays riches Tuberculose, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa Pneumonies, IST Infections liées aux soins, Légionellose Un problème majeur émergent dans le monde La résistance aux antibiotiques