(0.5 pt) (0.5pt) (0.5 pts) (1 pt) (0.5 pt) (0.5pt) (1pt) (0.5pt)

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1 Exercice 1 (5 points) Le pourcentage de cellules en phase G1, S et G2/M d une culture cellulaire en croissance peut être évalué en marquant l ADN avec une molécule fluorescente qui possède une capacité à se lier à l ADN tel que l Iodure de Propidium (fluorescence rouge). L intensité de fluorescence contenue dans chaque cellule peut être alors quantifiée. Cette technique peut être complétée en incubant les cellules pendant un temps relativement bref avec un précurseur de l ADN, le BrdU, un analogue de la thymidine (fluorescence verte) 1- Pourquoi le marquage au BrdU est- il utilisé en complément du marquage à l Iodure de Propidium? Pour préciser le pourcentage en phase S. Une mesure de la quantité d ADN n est pas très précice. (0.5 pt) Les quantités de BrdU et de iodure de propidium par cellule sont quantifiées et reportées sur un graphe dont l allure générale est représentée ci- dessous. 2- Donnez un titre aux axes x et y. axe x : intensité de fluorescence obtenue avec l iodure de propidium/cellule (0.5pt) axe y : Intensité du marquage BrdU/cellule (0.5 pts) 3- Représentez les résultats que vous obtiendriez à partir d une population en phase exponentielle de croissance marquée au BrdU et Iodure de Propidium Graphe en fer à cheval. (1 pt) 4- Vous justifierez l allure de ce graphe. (2.5 points) Les cellules en G1 et en G2 sont concentrées en deux zones. (0.5 pt) Début de S : la réplication se produit à partir de quelques origines de réplications (0.5pt) Milieu de S : la réplication se poursuit à partir des origines de réplications initiées en début de S et d autres origines de réplication sont mobilisées progressivement. L incorporation du BrdU est maximale en milieu de la phase S. (1pt) Fin de S : la réplication est terminée sauf au niveau des régions d hétérochromatine. (0.5pt) Exercice 2 (5 points) Vous réalisez une immunoprécipitation sur un extrait de protéines obtenu à partir de cellules humaines cultivées en présence de l Acide Aminé 35 S- Methionine. Vous utilisez différents anticorps, maba, mabb, mabc dirigés respectivement contre les protéines A, B et C de masses moléculaires différentes. L anticorps mab0 est également utilisé. Cet anticorps n est en principe dirigé contre aucune protéine humaine et est utilisé comme contrôle de l expérience. Les protéines présentes dans l immunoprécipitat sont analysées par autoradiographie (Fig 1) et par western blot (Fig 2). 1. Donnez le principe de l immunoprécipitation

2 On utilise un extrait cellulaire (0.5 pt). Un anticorps en excès alourdi par une bille de sépharose (ou une bille magnétique) et on incube le tout un certain temps, on centrifuge (ou on utilise un aimant) (0.5pt). On dissocie les complexes et on soumet à une électrophorèse les protéines (0.5pt). 2. A quoi sert le contrôle mab0 dans cette expérience? A identifier les protéines qui se fixent de manière non spécifique à l anticorps (0.5 pt) 3. Interprétez l ensemble des résultats obtenus dans les Fig 1 et 2. Chaque anticorps immunoprécipite la protéine ciblée par l anticorps et ses partenaires potentiels. Une comparaison de l intensité des bandes immunoprécipitées révélées par autoradiographie suggère que, pour chaque immunoprécipitation, la cible directe de l anticorps est la bande majoritaire révélée par autoradiographie (0.5 pt). Cette hypothèse est confirmée par Western blot dans lequel une bande majoritaire est détectée par les anticorps maba, mabb ou mabc (0.5 pt). L analyse des résultats suggère que dans le complexe analysé, A est associé à B, et C est associé à B (0.5pt). B est associé à A et C (1 pt) (fait le pont entre A et C). Les bandes non spécifiques sont présentes quelque soit l anticorps (0.5 pt). (dans cet exercice les chaines lourdes et légères des anticorps ne sont pas visibles car les anticorps ne sont pas marqués par l Acide Aminé 35S- Methionine Exercice 3 (5 points) On analysera ici le rôle du SRP et de son récepteur, dans la synthèse de 2 protéines types, la globine et la préprolactine qui est maturée en prolactine dans le réticulum endoplasmique granuleux. Dans différents tubes contenant un système de traduction in vitro (contenant des ribosomes, des ARN de transfert, de l ATP, des acides aminés, des enzymes et différents facteurs intervenant pour l'initiation de la traduction et pour l'élongation des polypeptides) sont ajoutées des doses croissantes de SRP. La quantité de protéine traduite en fonction de la dose de SRP est présentée dans la figure Indiquez ce qui manque au système de traduction in vitro pour obtenir la preprolactine et la globine. De l ARN de globine ou de prolactine (1 pt)

3 Une expérience légèrement différente à la précédente a été réalisée, dans laquelle un élément a été ajouté au système de traduction in vitro. La quantité de protéine traduite (préprolactine, prolactine et globine) en fonction de la dose de SRP est présentée dans la figure Indiquez ce qui a été modifié dans le schéma expérimental entre les Figures 1 et 2 On ajoute du réticulum endoplasmique granuleux (REG) traité à la ribonucléase et ne contenant pas de protéine SRP est ajouté au système de traduction in vitro (1 point) 3. Interprétez brièvement chacune des courbes obtenues dans les Figures 1 et 2. Réponse 3 : la SRP inhibe la traduction de l ARN qui code pour la préprolactine de manière dose dépendante. Cette protéine est maturée et possède dans sa région N ter une séquence signal. En absence de réticulum, les protéines ne peuvent plus être traduite. Ceci évite que les protéines qui doivent passer par le reticulum ne soient déversées dans le cytoplasme. (1pt) La SRP n a pas d action inhibitrice globale, il faut qu elle soit associée à la protéine pour que ce blocage se fasse, ce qui explique l inhibition dose dépendante. (0.5pt) La synthèse de globine n est pas affectée par la SRP. Ce résultat est normal. Cette protéine ne contient pas de peptide signal. Elle ne s associe pas à la SRP. Cette protéine n est pas destinée à être sécrétée et donc n est pas destinée à passer par le réticulum (0.5pt) La préprolactine est maturée en prolactine lorsque le REG est ajouté. Les protéines peuvent maintenant être transloquées dans le réticulum. Le peptide signal est éliminé pour donner la prolactine. (1 pt) Figure 1 Figure2 Exercice 4 (5 points) Vous disposez d une suspension de protéines de 15 µg/µl. Vous souhaitez déposer une quantité croissante de cette suspension dans les puits d un gel de polyacrylamide en vue de réaliser un western blot. La quantité déposée varie de 10 ng, 100 ng, 1 µg, 10 µg. Vous disposez uniquement d une pipette dont le volume peut varier de 1 à 20 µl et de tubes de 1,5 ml. Le volume déposé (10 µl) doit être identique dans tous les puits. 1. Proposez un protocole de dilution adapté aux contraintes indiquées. Respect des consignes (1 pt) (pipette et tube, volume déposé de 10 µl) Résultats corrects : retirer 1 pt pour chaque erreur de dilution. Solution : si on réalise une dilution au 15 x on obtient une solution à 1µg/µL (dilution 15x = 1 µl de la solution 15 µg/µl et 14 µl de tampon). Pour le puits 10µg dans 10 µl on dépose 10 µl de la solution diluée 15x

4 Pour le puits 1µg/µL on dépose 1µL de la solution 1µg/µL et on complète avec 9µL de tampon Pour le puits 100 ng/µl, on dilue 10 x la solution 1 µg/µl (1µL de solution 1 µg/µl +9µL de tampon) et on dépose 1 µl dans le puits +9µL de tampon. Pour le puits 10 ng/µl, on dilue 10 x la solution 100 ng/µl (1µL de solution 100 ng/µl +9µL de tampon) et on dépose 1 µl dans le puits + 9µL de tampon. PS : il y a évidemment plein d autres manières de procéder

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